除草剂生物筛选研究进展_王树凤

第4卷第4期农药学学报V ol.4　N o.4 2002年12月C HIN ESE J O U RN AL O F P EST ICID E SCIEN CE December2002

除草剂生物筛选研究进展

王树凤1*,　徐礼根2,　马建义3,　陈　杰4

(1.中国亚热带林研究所生物技术室,浙江富阳311400;2.浙江大学生命科学学院,浙江杭州310012; 3.浙江省林学院资源与环境系,浙江临安311300;4.国家南方农药创制中心浙江基地,浙江杭州310023)

摘要:生物筛选是除草剂研制开发的重要组成部分。综述了近年来除草剂生物筛选技术的发展概

况,重点介绍了除草剂筛选新方法——高通量筛选技术,并指出我国在除草剂筛选方面存在的不足

以及解决方案。

关键词:除草剂;生物筛选;高通量筛选;组合化学

中图分类号:S482.4 文献标识码:A 文章编号:1008-7303(2002)04-0003-07

农药在保护农作物免受有害生物侵害,保证其产量和质量方面起着举足轻重的作用。目前新农药不断出现,同时又不断淘汰和限制了药效差、存在毒性和环境问题的部分农药品种的应用,因此农药品种一直处于不断更新的动态发展中,在这种情况下新农药的创制开发成为世界农药界竞争的焦点。然而由于新药登记严格的环境要求以及生物对农药抗性问题的加重,新农药的创制变得越来越困难,约10万个化合物才有一个能转化为市场化的新农药[1]。但近年来由于组合化学(com bina to rial chemistry)在化学合成中的应用,使得化合物合成的速度大大提高,一个公司年合成能力可达几十万个化合物,这样,被誉为新农药研究开发“眼睛”的生物筛选(bio logical screening)变得越来越重要。

除草剂是与人类生存活动密切相关的一类重要农药,自1942年美国的P.W. Zim merman和 A.E.H itchcock发现2,4-D的除草活性以来,除草剂工业飞速发展,在三大类农药中,除草剂占的比例达47%之多[2]。除草剂的生物筛选是指利用各种生物测定技术从大量合成的化合物中发现除草活性的新化合物的过程,筛选程序一般要经过室内初筛——盆栽试验——田间试验三个步骤[3,4]。

除草剂的研发已有半个多世纪,用于除草剂生物筛选的生测方法有很多,并且不断有新的方法被建立。世界各大农药公司也已建立了自成体系的规范化的筛选系统,并根据形势的发展而不断进行改进与完善,原来的常规活体筛选现已发展到高通量筛选(high-th roug hput screening简称HT S,也可称为high-throughput bioassay screening,HTBS)甚至超高通量筛选(ultra high-th ro ug hput screening,U HTS)[1]。

1　常规筛选

常规筛选一般是利用生物活体作靶标,通过观察靶标生物对新化合物在生长发育、形态特征、生理生化等方面的反应来判断新化合物的生物活性。除草剂的作用方式很多,如抑制光合

①作者简介:王树凤(1977-),女,山东潍坊人,硕士,目前在国家南方农药创制中心浙江基地从事新除草剂的

生物筛选模式研究.

4农　药　学　学　报V ol.4

作用、呼吸作用、细胞分裂,干扰蛋白质、脂类、叶绿素等的生物合成以及生长的激素控制等,因此在进行除草剂活性初筛时,应根据新化合物的不同作用方式选择不同的靶标生物和相应的筛选方法。特别是对于定向筛选而言,这一点尤为重要。常用作筛选的单子叶植物有稗草Echinoc hloa crus-galli Beaur.、燕麦Arena fatua L.、马唐Digitaria sanguinalis(L.)Sco p.、小麦Triticum monoc ocum、高粱Sorghum bicolor(L.)Mo ench,双子叶植物有油菜Brassica napus、亚麻Linum ustitatissimum L.、黄瓜Cucum is sativas L.、萝卜Raphanus sativas L.和牵牛花Ipormoea nil(L.)Roth等[5];在筛选技术方面,国内外也建立了许多用于筛选不同种类除草剂的生物测定方法,主要有:培养皿法、小杯法、稗草胚轴法、高粱法、去胚乳小麦幼苗法、玉米幼苗法、萝卜子叶法、浮萍法、绿藻法、黄瓜幼苗形态法、烟草叶片浸渍法等[5]。

对于随机合成的化合物,则必须要进行随机筛选或普筛。为了减少漏筛的几率,往往需要将几种筛选方法联用。例如20世纪70年代我国有关研究单位开展了除草剂简易初筛方法的研究,建立了高粱法、小球藻法和萝卜子叶法为主的筛选模式,将这3种方法联用,对所有试验除草剂都有反应,且抑制生长50%的浓度均在100mg/L以下,因而可将上述方法联用作为简易的初筛模式[3]。目前我国从事新农药创制的各个基地在进行除草剂筛选时,初筛主要是采用培养皿法,也称种子萌发法,将选定的靶标生物的种子放入铺有双层滤纸的培养皿中,加入单一剂量或3～5个梯度剂量的新化合物,然后放入人工气候箱中培养,7d后对种子的萌发率、根或茎的抑制情况、鲜重等指标进行统计,计算抑制率为50%时的化合物浓度,从而判断化合物是否出线。但研究发现[6],培养皿法对大部分光合作用抑制型除草剂难以检出。

常规筛选由于采用生物活体作靶标,包含生物体的全部信息,与在田间条件下获得的结果更加接近,而且不容易漏筛,所以国外有些公司把某些作用较明确的新化合物直接进行常规药效试验,而省略了第一步的生物活性初筛。但常规筛选由于受生物体本身生长规律的限制,筛选周期比较长,一般为7d左右;其次,常规筛选的化合物用量比较大,而且对于那些溶解度小、在植物体内传导性差的化合物需要助剂以使其均匀分布于植物表面,助剂的使用必然会影响化合物的药效;另外,常规筛选的工作量也比较大,在人力、物力方面比较浪费。所有这些都决定了常规筛选难以达到标准化、自动化、规范化的操作,因而限制了年筛选的化合物量。如采用活体常规筛选,我国年筛选量仅1000～2000只化合物,国外大型农药公司也只有5000～10000只化合物[7],这样的筛选速度远远不能适应组合化学合成的筛选。

2　高通量筛选

2.1　高通量筛选的产生

目前,国外越来越多的大农药公司在新农药研发中采用组合化学工艺,运用“液相机器人”和固相自动化实现了化合物合成全自动化,包括制备、分离纯化、分析测试、实验数据记录及整理、化合物注册存入数据库的全过程的自动化,使得化合物的合成速度大大提高,例如Zeneca 农化公司的Zymark机器人系统一次运行可合成50～100个化合物,相当于一个专家组的工作,一个公司年合成能力可达几十万个化合物[7]。组合化学具有高效率、多样分子合成的特点,在短时间内可以合成成千上万个化合物,如果没有与之相适应的高效率筛选手段,组合化学无法发展,这就是高通量筛选得以发展的重要背景。这是一种将组合化学、基因组研究、生物信息