干细胞成骨分化和成脂分化后的表征方法及原理

干细胞成骨分化和成脂分化后的表征方法及原理
YAO Xiang
由于易分离获得、免疫原性低且具有多向诱导分化潜能，骨髓基质干细胞（Bone marrow stroma stem cells，MSCs）成为了组织工程与再生医学中理想的种子细胞。

正是由于上述原因，骨髓基质干细胞成为了很多研究者关注并使用的模型细胞。

在我的另一篇百度文献《干细胞诱导分化的方法及各类诱导试剂的配置》中已经详细介绍了骨髓基质干细胞的成骨诱导分化、成软骨诱导分化和成脂诱导分化的参考“诱导方案”及相应诱导试剂的配置和诱导试剂的详细原材料信息。

本文将侧重于介绍骨髓基质干细胞成骨和成脂诱导分化后的表征方法（包括染色表征及利用RT-PCR对相应特征性基于的表达进行表征）及相关原理，这些内容将解答我们怎样快速而有效地表征各个实验组别中成骨和成脂分化的相对强弱。

相关参考内容能够让初步涉入该领域的科研工作者极大地缩短前期探索实验和文献搜索整合所耗费的时间。

本文主要涵盖内容如下：
1.成骨分化后的表征方法及原理—染色表征
2.成骨分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达
3.成脂分化后的表征方法及原理—染色表征
4.成脂分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达
5.成骨成脂共诱导的表征方法及原理—染色表征
6.成骨成脂共诱导的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达
注：下述各类方案经多次实验验证是行之有效的，笔者依据类似方案发表的部分参考文献如下：
1. Yao X, Peng R, Ding JD*. Cell-material interactions revealed via material techniques of surface patterning. Advanced Materials, 2013;25:5257-86. (材料领域TOP期刊)
2. Yao X, Hu YW, Cao B, Peng R, Ding JD*. Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation of stem cells. Biomaterials, 2013;34:9001-9. (生物材料领域TOP期刊)
3. Yao X, Peng R, Ding JD*. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and without induction media. Biomaterials, 2013;34:930-9.
一、成骨分化后的表征方法及原理—染色表征
干细胞成骨分化后会有明显的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，一般也简写为ALP）生成，经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色，未分化细胞则无明显颜色（如后面的图1或图2所示）。

最终可以通过统计各样品中细胞碱性磷酸酶的平均表达强度对其成骨能力进行评估对比。

既可以通过统计各样品中成骨分化细胞的百分比加以表征对比，也可以通过统计ALP染色照片的平均灰度（但需要固定各项拍摄参数）加以表征对比，还有一种方法便是溶解蓝色物质后测吸光度。

图1：干细胞成骨分化后的染色图片示例（ALP和细胞核的复合染色）。

从左到右依次为同一个视野在相差条件、明场条件及荧光条件下的照片记录。

其中染为蓝色的细胞即表明已经发生了
成骨分化，而未着色细胞则没有发生成骨分化。

蓝色物质生成原因：碱性磷酸酶将染色液中的α-磷酸萘酚钠（Naphthol AS-MX phosphate alkaline solution）水解，产生α-萘酚与Fast Blue RR偶联形成不溶性蓝色沉淀。

成骨分化后的碱性磷酸酶染色详细步骤参考（含细胞核染色）：
（1）将一小管固蓝染料（Fast Blue RR，产品编号FBS25 | CAS号14726-29-5 | SIGMA）加入到48 ml Milli-Q水中，磁力搅拌约30 min，使其完全溶解；
（2）待固蓝完全溶解后，向溶液中加入2 ml底物（Naphthol AS-MX phosphate alkaline solution，产品编号855 | CAS号1596-56-1 | SIGMA；需在临近染色前加，不可加入太早），继续搅拌5 min；
（3）吸去待染色样本中的细胞诱导液或培养液，PBS漂洗3次，每次5 min；
（4）加入4%的多聚甲醛，固定15 min；
（5）吸去固定液，PBS漂洗3次；
（6）加入由步骤（1）和（2）配制好的固蓝染液，染色30 min；
（7）吸去染液，PBS漂洗3次，去除残留染液；
（8）加入2 μg/ml的DAPI（产品编号D9542 | CAS号28718-90-3 | SIGMA）染液（对细胞核进行荧光染色），染色5 min；
（9）PBS漂洗3次，去除残留染液；
（10）加入PBS，将样本置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

干细胞成骨分化后的典型染色照片图1和图2所示。

图2：干细胞成骨分化后的染色图片示例。

此处展示的是一个相对较大视野下的ALP染色结果（明场环境成像），其中染为蓝色的细胞即表明已经发生了成骨分化，而未着色细胞则没有发生
成骨分化。

另外，长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐的方式沉淀下来，并形成我们常说的“钙结节”。

因而在评估长时间的成骨诱导时，可选择“钙结节”进行染色。

钙结节的染色方法常用“茜素红”，染色原理就是茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的化合物，这样成骨诱导细胞外面沉积的钙结节就能被染成深红色。

染色后可以通过着色物的面积和深浅来表征成骨分化的强弱。

具体染色步骤参考如下：
（1）吸去待染色样本中的细胞诱导液或培养液，PBS漂洗3次，每次5 min；
（2）加入4%的多聚甲醛，固定15-30 min；
（3）吸去固定液，加入0.1%的茜素红（品编号A5533 | CAS号130-22-3 | SIGMA-ALDRICH）染色液，染色6-10min；
（4）PBS漂洗3次，去除残留染液；
（5）加入PBS，将样本置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

二、成骨分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达
干细胞成骨分化后将有明显的成骨细胞特征性基因表达。

如ALP（alkaline phosphatase）、Runx-2（runt related gene Ⅱ）等。

因而可以利用RT-PCR等方法来对相关基于的表达量加以测量，从而对比不同实验组别的成骨分化差异。

在RT-PCR测试中，一般选择的管家基因为GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），有时也称为内参基因，默认它的表达量是相对稳定的。

RT-PCR原理简介：RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即反转录PCR。

它首先利用反转录过程将RNA（特征基因表达产生的特异信使RNA）变为对应的cDNA，然后通过聚合酶链式扩增反应（PCR）对生成的DNA 加以扩增并测量。

通过测量结果可以反推到RNA表达量的多少，进而反映相关特征基因的表达量。

主要参考步骤如下（本例展示的是对少量细胞样品进行的RNA提取。

当样品中细胞量较大时，建议利用传统的TRIzon Reagent RNA提取试剂来提取RNA，这样可以节省大量成本）：
（1）干细胞成骨诱导完毕后，依据试剂盒（Promega公司的MagneSil total RNA mini-Isolation System）的标准流程提取每个细胞样本的RNA。

每个样本提取的RNA最终溶解在50 μl 水中（RNase-free，试剂盒自带），提取完毕后可将样本置于-80℃冰箱中保存备用；
（2）利用ThermoFisher Scientific公司的NanoDrop 2000对提取RNA的浓度进行检测，每次用样1 μl；
（3）每样本量取15 ng前述提取的RNA，然后利用TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒在20 μl体系中对RNA进行
反转录，合成后续实验所需的cDNA；
（4）依据标准实验流程，在20 μl体系中，利用预先设计好的引物（见Table 2.1）在Qiagen公司的Rotor Gene Q System进行定量PCR实验，选用的试剂盒为Qiagen公司的Rotor-GeneTM SYBR® Green PCR Kit。

（5）对实验数据采用2-△△Ct的方法加以分析处理，实验中选择的管家基因为GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），最终实验数据选择一个参照组别进行归一化处理。

Table 2.1. RT-PCR primer sequences of the osteogenic marker genes.（此处设计的引物序列适合SD大鼠种属，适宜人类的引物可参考大量文献报道）
Runx-2GATTACAGA TCCCAGGCAGAC CAGAGGCAGAAGTCAGAGGT
ALP ATGGTAACGGGCCTGGCTACA AGTTCTGCTCATGGACGCCGT
GAPDH GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAG TGGTAACCAGGCGTCCGAT
三、成脂分化后的表征方法及原理—染色表征
在干细胞的成脂诱导中，成脂后细胞的胞浆中将会有油滴（也称为脂肪滴）的产生和积累，随着时间的延长将不断增多变大。

因而可以考虑通过利用Oil Red O（油红）试剂将油滴标记为红色来加以表征。

干细胞成脂分化后会有明显的脂肪滴产生，经油红染色后在显微镜下呈现显著的红色，未分化细胞则无明显颜色，典型照片如图3所示。

最终可以通过统计各样品中成脂分化细胞的百分比来对成脂分化强弱加以表征对比。

图3：干细胞成脂分化后的染色图片示例（脂肪滴和细胞核的复合染色结果）。

从左到右依次为同一个视野在相差条件、明场条件及荧光条件的照片记录。

其中染为红色的细胞即表明已经发生了成脂分化，而未着色细胞则没有发生成脂分化。

红色物质生成原因：Oil Red O是一种亮红色的油溶性染料，这里主要利用的便是该试剂的油溶性，进而对细胞内的脂肪滴（油滴）有较强的着色力，而对其它的细胞结构着色性差。

具体染色参考步骤如下（含细胞核的荧光染色）：
（1）吸去待染色样本中的细胞诱导液或培养液，PBS漂洗3次，每次5 min；
（2）加入4%的多聚甲醛，固定15 min；
（3）吸去固定液，PBS漂洗3次，每次5 min；
（4）加入60%的异丙醇，漂洗样本30 s后立即吸弃；
（5）加入油红O染液（产品编号O0625 | CAS号1320-06-5 | SIGMA-ALDRICH）（30 mg/ml，用60%的异丙醇配置），染色15 min；
（6）吸去染液，PBS漂洗3次，去除残留染液；
（7）加入2 μg/ml的DAPI染液（对细胞核进行荧光染色），染色5 min；
（8）PBS漂洗3次，去除残留染液；
（9）加入PBS，将样本置于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

四、成脂分化后的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因的表达
干细胞成脂分化后将有明显的成脂特征性基因表达。

如LPL（lipoprotein lipase）、PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptors γ）等。

因而可以利用RT-PCR等方法来对相关基于的表达量加以测量，从而对比不同实验组别的成脂分化差异。

在RT-PCR测试中，一般选择的管家基因为GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），有时也称为内参基因，默认它的表达量是相对稳定的。

RT-PCR原理简介：RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即反转录PCR。

它首先利用反转录过程将RNA（特征基因表达产生的特异信使RNA）变为对应的cDNA，然后通过聚合酶链式扩增反应（PCR）对生成的DNA 加以扩增并测量。

通过测量结果可以反推到RNA表达量的多少，进而反映相关特征基因的表达量。

主要参考步骤如下（本例展示的是对少量细胞样品进行的RNA提取。

当样品中细胞量较大时，建议利用传统的TRIzon Reagent RNA提取试剂来提取RNA，这样可以节省大量成本）：
（1）干细胞成脂诱导完毕后，依据试剂盒（Promega公司的MagneSil total RNA mini-Isolation System）的标准流程提取每个细胞样本的RNA。

每个样本提取的RNA最终溶解在50 μl 水中（RNase-free，试剂盒自带），提取完毕后可将样本置于-80℃冰箱中保存备用；
（2）利用ThermoFisher Scientific公司的NanoDrop 2000对提取RNA的浓度进行检测，每次用样1 μl；
（3）每样本量取15 ng前述提取的RNA，然后利用TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒在20 μl体系中对RNA进行反转录，合成后续实验所需的cDNA；
（4）依据标准实验流程，在20 μl体系中，利用预先设计好的引物（见Table 4.1）在Qiagen公司的Rotor Gene Q System进行定量PCR实验，选用的试剂盒为Qiagen公司的Rotor-GeneTM SYBR® Green PCR Kit。

（5）对实验数据采用2-△△Ct的方法加以分析处理，实验中选择的管家基因为GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），最终实验数据选择一个参照组别进行归一化处理。

Table 4.1. RT-PCR primer sequences of the osteogenic marker genes.（此处设计的引物序列适合SD大鼠种属，适宜人类的引物可参考大量文献报道）
PPARγCCTTTACCACGGTTGATTTCTC GGCTCTACTTTGATCGCACTTT
LPL ATGGA TGGACGGTGACAGGA CCAAGACTGTACCCTAAGAGGTG
GAPDH GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAG TGGTAACCAGGCGTCCGAT
五、成骨成脂共诱导的表征方法及原理—染色表征
干细胞经成骨成脂共诱导后，可以结合前述单独的成骨和成脂表征方法加以染色表征，及通过复合染色的方案来进行评估。

可考虑首先利用固蓝对其成骨标记物碱性磷酸酶进行染色，然后利用油红O对其成脂标记物脂肪滴进行染色，最后用DAPI对细胞核进行染色标记（以确定细胞的位置和数量）。

染色原理同单独的碱性磷酸酶和脂肪滴染色一样，所用试剂也基本一样。

此处需要注意的是染色的先后顺序。

具体染色步骤如下：
（1）将一小管固蓝染料（Fast Blue RR）加到48 ml Milli-Q水中，磁力搅拌约半小时使其完全溶解；
（2）待固蓝完全溶解后，向溶液中加入2 ml底物（Naphthol AS-MX phosphate alkaline solution，需在临近染色前加，不可加入太早），继续搅拌5 min；
（3）吸去待染色样本中的细胞诱导液，PBS漂洗3次，每次5 min；
（4）加入4%的多聚甲醛，固定15 min；
（5）吸去固定液，PBS漂洗3次；
（6）加入由步骤（1）和（2）配制好的固蓝染液，染色30 min；
（7）吸去染液，PBS漂洗3次，去除残留染液；（碱性磷酸酶染色完毕）（8）加入60%的异丙醇，漂洗样本30 s后吸去；
（9）加入油红O染液（30 mg/ml，用60%的异丙醇配置），染色15 min；
（10）吸去染液，PBS漂洗3次，去除残留染液；（脂肪滴染色完毕）
（11）加入2 μg/ml的DAPI染液（对细胞核进行荧光染色），染色5 min；
（12）PBS漂洗3次，去除残留染液；
（13）加入PBS，将样本置于倒置荧光显微镜（如Axiovert 200，Zeiss）下观察并拍照记录。

干细胞成骨分化后会有明显的碱性磷酸酶表达，经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色，干细胞成脂分化后会有明显的脂肪滴表达产生，经油红O染色后在显微镜下呈现红色，未分化细胞则无明显颜色，典型照片如图4所示。

对照片进行计数统计后最终可以每样品上成骨细胞和成脂细胞的百分比来分别对其成骨、成脂状况进行表征与评估。

图4：干细胞成骨成脂共诱导后的染色图片示例（ALP、脂肪滴和细胞核的复合染色结果）。

从上到下依次为同一个视野在相差条件和荧光条件（细胞核）下的照片记录。

其中染为蓝色的细胞即表明已经发生了成骨分化、染为红色的细胞即表明已经发生了成脂分化，而未着色细胞则没有发生成骨或成脂分化。

六、成骨成脂共诱导的表征方法及原理—RT-PCR表征特征基因表达
干细胞成骨、成脂分化后将有明显的成骨与成脂特征性基因表达。

如成骨特征性基因ALP（alkaline phosphatase）、Runx-2（runt related gene Ⅱ）；成脂特征性基于LPL（lipoprotein lipase）、PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptors γ）等。

因而可以利用RT-PCR等方法来对相关基因的表达量加以测量，从而对比不同实验组别的成骨和成脂分化差异。

在RT-PCR测试中，一般选择的管家基因为GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），有时也称为内参基因，默认它的表达量是相对稳定的。

RT-PCR原理简介：RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即反转录PCR。

它首先利用反转录过程将RNA（特征基因表达产生的特异信使RNA）变为对应的cDNA，然后通过聚合酶链式扩增反应（PCR）对生成的DNA 加以扩增并测量。

通过测量结果可以反推到RNA表达量的多少，进而反映相关特征基因的表达量。

主要参考步骤如下（本例展示的是对少量细胞样品进行的RNA提取。

当样品中细胞量较大时，建议利用传统的TRIzon Reagent RNA提取试剂来提取RNA，这样可以节省大量成本）：
（1）干细胞成骨成脂共诱导完毕后，依据试剂盒（MagneSil total RNA mini-Isolation System，Promega公司）的标准流程提取细胞样本的RNA，每样本提取的RNA最终溶解在50 μl 水中（RNase-free，试剂盒自带）。

提取完毕后可将样本置于-80℃冰箱中保存备用；
（2）利用ThermoFisher Scientific公司的NanoDrop 2000对不同样本RNA 的浓度进行测量，每次加样1 μl；
（3）每样本量取15 ng前述提取的RNA，然后利用TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒在20 μl体系中对RNA进行反转录，合成后续实验所需的cDNA；
（4）依据标准实验流程，在20 μl体系中，利用预先设计好的引物（见Table 6.1）在Qiagen公司的Rotor Gene Q System进行定量PCR实验，选用试剂盒为Qiagen公司的Rotor-GeneTM SYBR® Green PCR Kit。

（5）实验数据利用2-△△Ct的方法加以分析处理，选择的管家基因为GAPDH
（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），最终实验数据选择一个参照组别进行归一化处理。

Table 6.1. RT-PCR primer sequences of the osteogenic and adipogenic marker genes. （此处设计的引物序列适合SD大鼠种属，适宜人类的引物可参考大量文献报道）
ALP ATGGTAACGGGCCTGGCTACA AGTTCTGCTCATGGACGCCGT
Runx-2GATTACAGA TCCCAGGCAGAC CAGAGGCAGAAGTCAGAGGT
LPL ATGGA TGGACGGTGACAGGA CCAAGACTGTACCCTAAGAGGTG
PPARγCCTTTACCACGGTTGATTTCTC GGCTCTACTTTGATCGCACTTT
GAPDH GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAG TGGTAACCAGGCGTCCGAT。