改良凝集试验_MAT_检测鸡弓形虫血清抗体

笼 养 鸡 阳 性 ２５ 例 ，阳 性 率 为 ５．５６％ （２５／４５０），Ｘ２ ＝ ２５．０４８９。 统 计 学 分 析 显 示 差 异 极 显 著 （Ｐ＜０．０１）。
从鸡的 饲 养 用 途 来 看，蛋 鸡 阳 性 １５ 例、阳 性 率 ７．８９％（１５／１９０），肉鸡阳性 ２ 例、阳 性 率 １．２５％（２／ １６０），种鸡阳 性 ８ 例、８％ （８／１００）Ｘ２ ＝８．７７３２。 统 计学分析显 示，蛋 鸡 与 种 鸡 之 间，差 异 不 显 著 （Ｐ＞ ０．０５）；蛋鸡与肉鸡之间，差异极 显 著（Ｐ＜０．０１）；种 鸡 与 肉 鸡 之 间 ，差 异 极 显 著 （Ｐ＜０．０１）。
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中 国 兽 医 学 报 ２０１４年１１月 第３４卷 第１１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｎｏｖ．２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１１
１ 材料与方法
１．１ 虫株及实验 动 物 弓 形 虫 标 准 强 毒 株 ＲＨ 株 速殖子、小鼠肉瘤细 胞 Ｓ１８０ 由 本 实 验 室 保 存；昆 明 小鼠购自 吉 林 大 学 实 验 动 物 中 心，雌 雄 不 限，２５ｇ 左右。 １．２ 血清 “弓 形 虫 间 接 血 凝 试 验 （ＩＨＡ）试 剂 盒” 的阴、阳性血清 作 为 标 准 品。 采 自 辽 宁 省 锦 州 市 鸡 血 清 ６１０ 份 ，其 中 ，散 养 鸡 １６０ 份 、笼 养 鸡 ４５０ 份 ；笼 养 鸡 包 括 蛋 鸡 １９０ 份 、蛋 种 鸡 １００ 份 、肉 鸡 １６０ 份 。 １．３ 抗 原 制 备 取 经 传 代 后 处 于 对 数 生长期小鼠 肉瘤 Ｓ１８０细 胞，１ ５００ｒ／ｍｉｎ离 心 １０ ｍｉｎ，弃 去 培 养 液，加入含２％胎牛血清的 ＲＰＭⅠ１６４０维持液８ｍＬ， 细胞计数约为２×１０４个／ｍＬ。接 种 弓 形 虫 ＲＨ 株 速 殖子，接种 量 为 １０６ 个／瓶，Ｓ１８０ 细 胞 被 速 殖 子 完 全 入侵 后 收 集 培 养 瓶 内 悬 液 ，３ ５００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １５ ｍｉｎ、 弃上清，加 ＰＢＳ洗涤。再用 ＰＢＳ悬浮沉淀，加６％甲 醛固定 １６ｈ。３ ５００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １５ ｍｉｎ、弃 上 清 ，ＰＢＳ 吹打洗涤沉淀，虫体悬浮于碱性缓冲液（８ｇ ＮａＣｌ，０．２ ｇ ＫＣｌ，３．８５ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ，０．２４ｇ ＫＨ２ＰＯ４，调 ｐＨ 值至８．９，定容至１Ｌ。），虫体浓度调整到２×１０７ 个／ｍＬ 作 为 抗 原 液 ，４℃ 保 存 待 用 。 １．４ ＭＡＴ 试验 待检血清用含 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ ２－巯基 乙醇的 ｐＨ７．２磷酸盐缓冲液自１∶２０起倍比稀释， ９６孔“Ｖ”型血凝板，每孔加待检血清稀释液 ５０μＬ； 加抗原液２０μＬ 和０．５μＬ 伊文思蓝，碱性缓冲液补 足至７５μＬ，震荡混匀。设标准阳性血清、阴 性 血 清 和空白对照。将血凝板置于３７℃培养箱孵育 １２ｈ。 判 断 标 准 ：如 孔 底 形 成 薄 膜 状 、形 态 均 匀 的 凝 集 物 为 阳性；如孔底形成 小 圆 点、中 间 有 空 斑，边 缘 有 毛 边 的 凝 集 物 为 疑 似 ；如 孔 底 呈 清 晰 圆 点 状 、周 围 光 滑 的 凝集物为阴性。在标准阴性血清和空白对照均为阴 性、标准阳性 血 清 抗 体 滴 度 不 低 于 １∶２００ 的 条 件 下 ，待 检 血 清 滴 度 大 于 或 等 于 １∶２０ 判 定 为 阳 性 。 １．５ 对 照 试 验 方 法 按 “弓 形 虫 间 接 血 凝 试 验 （ＩＨＡ）试 剂 盒 ”说 明 书 使 用 。 １．６ 数据处理 采用χ２ 检验统计结果。
大学 白求恩第二医院，吉林 长春 １３００４２；３．军事医学科学院 军事兽医研究所，吉林 长春 １３０１２２）
摘要：本研究是在 Ｄｕｂｅｙ Ｊ Ｐ 所建改良凝集试验基础上，采用小鼠肉瘤 Ｓ１８０细胞培养弓形虫速殖子，甲醛固定抗原 后悬浮于碱性缓冲液，用２－巯基乙醇处理待测血清，用该法对６１０份鸡血清进行弓形虫 抗 体 检 测，并 用 间 接 血 凝 试 验（ＩＨＡ）作对照。结果显示，ＭＡＴ、ＩＨＡ 对鸡血清的 弓 形 虫 抗 体 检 测 阳 性 率 分 别 为 ９．０２％ （５５／６１０）、１．６４％ （１０／ ６１０），二者差异极显著（Ｐ＜０．０１）。ＭＡＴ 对 鸡 的 弓 形 虫 抗 体 检 测 结 果，鸡 血 清 阳 性 率 为 ９．０２％ （５５／６１０），其 中 散 养鸡阳性率为１８．７５％（３０／１６０），笼养鸡阳性率为５．５６％ （２５／４５０），二 者 差 异 极 显 著 （Ｐ＜０．０１）；蛋 鸡 和 种 鸡 阳 性 率 分 别 为 ７．８９％ （１５／１９０）和 ８．００％ （８／１００）、肉 鸡 阳 性 率 １．２５％ （２／１６０），与 肉 鸡 相 比 差 异 显 著 （Ｐ＜０．０５）。 关 键 词 ：改 良 凝 集 试 验 （ＭＡＴ）；鸡 ；弓 形 虫 中 图 分 类 号 ：Ｓ８３１．７ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－４５４５（２０１４）１１－１７８１－０２
Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ
ＸＵ Ｙｕｅ１，ＷＡＮＧ Ｆｅｎｇ－ｙａｎｇ１，ＬＩＵ Ｘｉａｎ－ｙｉｎｇ２，ＷＥＩ Ｆｅｎｇ１＊ ，ＬＩＵ Ｑｕａｎ３＊ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ，Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００４２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ａｃａｄｅｒｎｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１２２，Ｃｈｉｎａ）
收 稿 日 期 ：２０１３－１２－０３ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （３１０７２１２７，３０１７０６９６） 作 者 简 介 ：许 越 （１９６７－），女 ，实 验 师 ，硕 士 。
＊通讯作者
重要的食物来源，也是人感染弓形虫的传染 源［２］，弓 形虫病对养鸡业 的 发 展 会 造 成 经 济 损 失。 因 此，建 立 快 速 、准 确 的 弓 形 虫 检 测 方 法 、及 时 进 行 流 行 病 学 的调查分析对人类及动物的健康具有重大意义。血 清学检测是诊断弓 形 虫 病 常 用 的 方 法 之 一，其 中 改 良凝集试验（ＭＡＴ）因其简易、敏感性和特异性 高 的 特点，被欧美国家广 泛 应 用 于 人 及 动 物 弓 形 虫 病 的 大 规 模 血 清 流 行 病 学 调 查 和 研 究［３］，而 国 内 运 用 此 方法的相关报道较少。
２ 结果
２．１ ＭＡＴ 和ＩＨＡ 检测结果 ６１０份鸡血清，ＭＡＴ 检测阳性 共 ５５ 例，阳 性 率 为 ９．０２％；ＩＨＡ 检 测，阳 性 １０ 例 ，阳 性 率 为 １．６４％ 。 ２．２ ＭＡＴ 检 测 鸡 血 清 结 果 从 鸡 的 饲 养 方 式 来 看，散养鸡阳性３０例，阳 性 率 为 １８．７５％（３０／１６０）；
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＭＡＴ）ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌ－ ｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ Ｄｕｂｅｙ Ｊ Ｐ．Ｔｈｅ ＲＨ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｗａｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｍｏｕｓｅ ｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌｓ Ｓ１８０．Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｉｎ ６％ ｆｏｒｍａｌｄｅ－ ｈｙｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｉｎ ａｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．９．Ｓｅｒａ ｗａｓ ｄｉｌｕｔｅｄ ｂｙ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ．Ａｌｌ ｓｅｒａ ｏｆ ６１０ｃｈｉｃｋｅｎ ｆｒｏｍ Ｌｉａｏｎｉｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＡＴ，ａｎｄ ｉｎ－ ｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＩＨＡ）ａｓ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｎ ｔｈｅ ＭＡＴ，ＩＨＡ ｃｈｉｃｋｅｎ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ９．０２％ （５５／６１０），１．６４％ （１０／６１０），ｂｏｔｈ ｖｅｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｆｒｅｅ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｆｅｄ ｉｎ ｃａｇｅｓ ｗｅｒｅ １８．７５％（３０／１６０）ａｎｄ ５．５６％ （２５／４５０）ａｎｄ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｌａｙｅｒ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｅｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ７．８９％ （１５／１９０）ａｎｄ ８％ （８／１００），ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｉｎ ｂｒｏｉｌｅｒ ｗａｓ １．２５％ （２／１６０），ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ （Ｐ＜０．０５）． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＭＡＴ）；ｃｈｉｃｋｅｎ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇａｏｎｄｉｉ
吕元聪［８］报道我 国 １４ 省 部 分 地 区 鸡 感 染 弓 形 虫平均阳 性 率 为 １５．６９％，江 涛 等 调 ［９］ 查 荆 州 地 区 的鸡弓形虫 感 染 情 况，阳 性 率 为 ２５．１７％。 锦 州 地 区的 ６１０ 份 鸡 血 清 的 阳 性 检 出 率 为 ９．０２％ （５５／ ６１０），其中散养鸡的阳性 率 为 １８．７５％，显 著 高 于 笼 养鸡５．５６％（Ｐ＜０．０１）；笼 养 鸡，蛋 鸡 的 阳 性 率 为 ７．８９％、肉 鸡 的 阳 性 率 １．２５％，种 鸡 的 阳 性 率 ８．００％。散养鸡的阳 性 率 高 于 笼 养 鸡，主 要 因 散 养 鸡被饲养在开放 的 地 面 上，可 自 由 移 动、采 食，容 易 食 入 散 落 在 饲 料 、泥 土 和 饮 水 中 的 弓 形 虫 卵 囊 ，此 外 散 养 户 多 为 农 村 地 区 ，养 猫 户 较 多 ，猫 的 流 窜 使 其 排 泄物的污染范围扩 大，增 加 了 散 养 鸡 感 染 弓 形 虫 的 可能。因此散养鸡的感染率常被作为某一地区弓形 虫污染情况的指示器 。 ［１０］ 笼 养 鸡 的 生 活 环 境 受 限， 饲料是其唯一的食 物 来 源，造 成 笼 养 鸡 感 染பைடு நூலகம்弓 形 虫 的主要途径就是被卵囊污染的饲料和饮用水。商品 蛋鸡和种鸡的阳性 率 也 显 著 高 于 肉 鸡，分 析 原 因 可 能 是 产 蛋 鸡 和 种 鸡 的 生 活 周 期 一 般 在 １～２ 年 ，较 肉 鸡（生活周期不到２ 个 月）长 很 多，因 而 接 触 弓 形 虫 卵 囊 的 机 会 增 多 ，造 成 了 感 染 率 比 肉 鸡 高 。
３ 讨论
改 良 凝 集 试 验 （ＭＡＴ）是 在 直 接 凝 集 试 验 （ＤＡＴ）的基 础 上 发 展 而 来，直 接 凝 集 试 验 是 ２０ 世 纪５０年代首次报道并用于弓形虫检测［３］，但因 其 特 异性和敏感性不高，因为未得 到 广 泛 应 用。２０ 世 纪 ８０年代，弓形 虫 直 接 凝 集 试 验 进 行 了 改 进，即 改 良 凝集 试 验 （ＭＡＴ），大 大 地 提 高 了 特 异 性 和 敏 感 性［４］，并成功 研 制 试 剂 盒。 欧 美 国 家 将 ＭＡＴ 用 于 人和动物弓形虫感 染 的 调 查 和 研 究，如 法 国 用 于 母 婴 弓 形 虫 感 染 的 筛 选 和 诊 断［５］，美 国 用 于 诊 断 艾 滋 病病人弓形虫脑炎和猪弓形虫流行病学 的 调 查 。 ［６－７］ 我 们 采 用 小 鼠 肉 瘤 Ｓ１８０ 细 胞 培 养 弓 形 虫 速 殖 子 ，然 后用福尔马林固定 抗 原，提 高 了 该 方 法 的 敏 感 性 和 特异性，被检血清用 ２－巯 基 乙 醇 处 理 后 又 可 进 一 步 去除非特异性抗体的干扰。
＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ
弓形虫是一种 细 胞 内 寄 生 原 虫，可 感 染 人 及 所 有温血动物，引 发 疾 病 甚 至 死 亡 。 ［１］ 弓 形 虫 病 是 由 弓 形 虫 引 起 的 、呈 世 界 分 布 的 人 兽 共 患 寄 生 虫 疾 病 ， 弓形虫病严重威胁人类健康。鸡肉及其制品是人类
中 国 兽 医 学 报 ２０１４年１１月 第３４卷 第１１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｎｏｖ．２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１１
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改良凝集试验（ＭＡＴ）检测鸡弓形虫血清抗体
许 越１，王凤阳１，刘贤英２，魏 峰１＊ ，刘 全３＊ （１．吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 １３０１１８；２．吉林