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小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离

小鼠尾静脉取血

所需器材:

热光源(如:普通台灯),鼠尾固定器,刀片,1.5mlEP管。

步骤:

1.烘烤。用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。烤至小鼠开始有剧烈反应

时,关掉热源。

2.割尾。烤完后将小鼠固定将尾部露在外面,用刀片割一下鼠尾远

心端腹侧静脉血管使血液流出,立即用 1.5mlEP收集滴下来的血液。

3.止血。用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血,以防失血过多

死亡。

要点

1.烤:

烤的不够:血管未膨胀,割尾后血液不易流出。

烤的太过:小鼠死亡。

2.割:

割的太浅:血液不流出。

割的太深:鼠尾被割断。

后续应用:

取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。所取血可用于血液学指标的检测,如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。

附表:本实验室常用的2种取血方法的比较

尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血

小鼠脾淋巴细胞分离

所需器材(以下均为取1只鼠脾需准备的量):

手术器械——剪刀、镊子至少2套(高压灭菌),止血钳一个(高压灭菌),细头玻璃吸管一根(高压灭菌),,200目尼龙网一张(高压灭菌),一次性5ml注射器一支,15ml和50ml离心管各一个,60mm中皿及血球计数板一块。

所需试剂:

小鼠淋巴细胞分离液,无血清1640,进口血清,青链霉素(双抗)(100X),NEAA,丙酮酸钠,谷氨酰胺,β-巯基乙醇

注:200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。

分离原理示意图

图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图

分离步骤及要点:

1.断颈处死小鼠,75%乙醇中浸泡几分钟消毒。

2.将小鼠转移至超净台中,先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使

腹腔内脾脏可见。换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔,小心用镊子夹出脾脏,用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。脾脏位于小鼠左侧腹部,为一暗红色长条形器官,不要误取肾和肝。

取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。注意无菌操作。

3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液,用止血钳将尼龙

膜固定在中皿上,放上脾脏开始研磨(如图一所示)。注意利用尼龙膜的弹性研磨。研磨时间不要超过5分钟,否则淋巴细胞分离液挥发导致其密度发生改变,影响分离效果。

4.将上述中皿中的淋巴细胞分离液转移至15ml离心管,沿管壁

小心加入约200ul的无血清RPMI1640,立即旋紧管盖,800g

室温离心30分钟。注意室温离心!加速度如有10档,设为第3档。

5.离心后细胞分层如上图二所示。用细头玻璃吸管将淋巴细胞层

吸出至50ml离心管中,加入10倍体积无血清1640培养基,

混匀后250g室温离心10 分钟。

6.小心弃去上清,用1ml淋巴细胞培养基重悬细胞计数,稀释

200倍计数。一般能取到0.5-1*108个/脾。按适当密度种至培

养皿中,37度,5%CO2培养。

注意全程无菌操作!

注:

此处所分离细胞为单个核细胞(PBMC),为细胞混合物,其中主要是淋巴细胞,淋巴细胞中又以B淋巴细胞为主。

后续试验:

分离到的淋巴细胞可继续用磁珠分选纯的B细胞、T细胞做相应检测(提基因组,提蛋白检测某基因表达等),在本人实验中分选到的淋巴细胞使用LPS刺激后只有B淋巴细胞增殖,之后使用逆转录病毒感染,将感染的B淋巴细胞作为基因治疗的靶细胞。

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