土贝母皂苷对人肝癌细胞HepG2增殖及细胞周期的影响

·论著·
土贝母皂苷－Ⅱ对人肝癌细胞ＨｅｐＧ２增殖及细胞周期的影响
晁旭　赵英永　魏敏慧　党琳　马晓军　王文娟
【摘要】　目的　探讨土贝母皂苷－Ⅱ对人肝癌细胞Ｈｅｐ
Ｇ２增殖、细胞周期的影响及其抗肿瘤效应。

方法　用不同浓度土贝母皂苷－Ⅱ０、２、４、６、８、１０、１２μｇ／ｍｌ处理ＨｅｐＧ２细胞后，ＭＴＴ法检测细胞生长的抑制率，荧光染色和流式细胞术分别观察凋亡细胞形态和细胞周期的变化。

同时，以Ｈ２２
肝癌小鼠模型初步探讨土贝母皂苷－Ⅱ的抗肿瘤作用。

结果　土贝母皂苷－Ⅱ能剂量依赖性地抑制ＨｅｐＧ２细胞生长，２４－ｈ半数抑制剂量（ＩＣ５０）
为４．０５μｇ／ｍｌ。

ＨｅｐＧ２细胞经土贝母皂苷－Ⅱ处理后，呈现典型的凋亡细胞形态，Ｇ２／Ｍ期细胞数量增加，而Ｇ０／Ｇ１期细胞数明显减少。

体内抗肿瘤实验结果证明，土贝母皂苷－Ⅱ对肿瘤的生长有显著的抑制作用。

结论　土贝母皂苷－Ⅱ可能是通过使肿瘤细胞滞留于Ｇ２
／Ｍ期，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

【关键词】 土贝母皂苷－Ⅱ；
细胞增殖；细胞周期【中图分类号】　Ｒ９６６ 【文献标识码】　Ａ 【文章编号】　０２５３－３６８５（２０１２）１５－１７４０－０３Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐ
ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅＨｅｐＧ２　ＣＨＡＯ　Ｘｕ，ＺＨＡＯ　Ｙｉｎｇｙｏｎｇ，ＷＥＩ　Ｍｉｎｈｕｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｈａｎｘｉ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　
Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉａｎｙａｎｇ　７１２０４６，ＣＨＩＮＡ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊ
ｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｈｅｐ
Ｇ２ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｉｔｓ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｆｔｅｒ　Ｈｅｐ
Ｇ２ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱ０，２，４，６，８，１０，１２μｇ／ｍｌ，ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　
ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｈａｐｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　
ａｎｄ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱｉｎ　ｖｉｖｏ　ｗａｓ　ｐｒｉｍａｒｉｌｙ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　
ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｈ２２ｒａｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｇ
ｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ａ　ｄｏｅｓ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＩＣ５０ｖ
ａｌｕｅ　ｗａｓ　４．０５μｇ／ｍｌ．Ａｆｔｅｒ　ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱ，ｃｅｌｌａｐｐｅａｒａｎｃｅ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｔｙｐｉｃａｌ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ　ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　
ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｎ　Ｇ２／Ｍ　ｐｈａｓｅ　ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　
ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｎ　Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ．Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱｃｏｕｌｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　
ｓｕｐｐｒｅｓｓ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｂａｂｌｙ　
ｖｉａ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｓｔａｇｎａｔｅ　ｉｎ　Ｇ２／Ｍ　ｐｈａｓｅ．【Ｋｅｙ　
ｗｏｒｄｓ】 Ｔｕｂｅｉｍｏｓｉｄｅ－Ⅱ；Ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ［Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇ
ｕｓｔ　２０１２，３８（１５）：１７４０－１７４２．］ 基金项目：
陕西省教育厅科研计划项目（１１ＪＫ０６８２）作者单位：７１２０４６　陕西中医学院基础医学院（
晁旭、魏敏慧、党琳、马晓军、王文娟）；西北大学陕西省生物医药重点实验室
（赵英永）
土贝母是一种传统中药，
曾被用来治疗肿瘤、炎症和蛇虫叮咬等［
１］。

目前，已经从其中分离出多种三萜皂苷［２－
４］，它们具有抑制多种癌细胞分化和增殖
的功能
［５，６］。

研究发现，土贝母皂苷－Ⅱ是最有希望
用于临床试验的化合物［７］。

许多抗肿瘤药物或具有肿瘤抑制作用的化合物是通过诱导肿瘤细胞的凋亡作用而达到抑制肿瘤发
生和进展的［８］。

土贝母皂苷－Ⅰ可以通过诱导ＨｅＬａ细胞线粒体丧失功能而使其凋亡［５］。

然而，有关土
贝母皂苷－Ⅱ的抗肿瘤作用及其诱导细胞凋亡机制的研究还没有报道。

本课题开展了土贝母皂苷－Ⅱ对人源肝癌细胞ＨｅｐＧ２的抑制作用及其诱导细胞凋亡的分子机制，并通过动物实验初步探讨了土贝母皂苷－Ⅱ的抗肿瘤作用机制。

材料与方法
一、材料
人源肝癌细胞Ｈｅｐ
Ｇ２购自第四军医大学；ＲＰＭＩ１６４０培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；
小牛血清购自·０４７１·江苏医药２０１２年８月第３８卷第１５期　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇ
ｕｓｔ　２０１２，Ｖｏｌ　３８，Ｎｏ．１５
民海生物有限公司；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）、胰蛋白酶等试剂购自Ｓｉｇｍａ公司。

二、方法
１．细胞培养　ＨｅｐＧ２细胞培养在含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基中（含１００Ｕ／Ｌ青霉素和１００μｇ／ｍｌ链霉素），于在３７℃、５％ＣＯ２的细胞培养箱中培养和传代。

２．ＭＴＴ法检测土贝母皂苷－Ⅱ对肿瘤细胞生长的影响　取对数生长期癌细胞悬液１８０μｌ（含细胞５×１０３个）分别加入９６孔培养板中。

培养１２ｈ后，分别加入２０μｌ相应浓度的土贝母皂苷－Ⅱ，使培养液中最终药物浓度为０、２、４、６、８、１０、１２μｇ／ｍｌ。

细胞于３７℃、５％ＣＯ２饱和相对湿度的培养箱中培养２４ｈ后，向每孔加入２０μｌ　ＭＴＴ溶液５ｍｇ／ｍｌ。

继续培养６ｈ后，小心地吸去培养液，向每孔加１５０μｌＤＭＳＯ，室温下在微孔板震荡器上震荡１０ｍｉｎ，在Ｅｌｘ－８００型自动酶联检测仪λ＝５７０ｎｍ下测定吸光值（Ａ值），并计算细胞抑制率。

３．ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳不同浓度的土贝母皂苷－Ⅱ处理细胞２４ｈ后，胰酶消化，离心、收集细胞。

用凋亡细胞ＤＮＡ提取试剂盒提取细胞基因组；在１．５％水平琼脂糖凝胶中电泳，并用紫外分析仪观察ＤＮＡ梯状条带。

４．荧光双染检测　用土贝母皂苷－Ⅱ６μｇ／ｍｌ处理ＨｅｐＧ２细胞１２ｈ后，收集细胞，加入荧光染料ＨＯＴＥＳＴ　３３２５８及碘化丙啶，使其终浓度均达到１０μｇ／ｍｌ，３７℃避光染色１５ｍｉｎ。

然后用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤细胞１次并离心沉淀。

将细胞涂于载玻片上，荧光显微镜观察细胞形态。

５．流式细胞术分析细胞周期的变化　按每孔１×１０４个细胞将ＨｅｐＧ２细胞悬液接种于６孔板培养，至对数生长期，加入相应浓度土贝母皂苷－Ⅱ溶液，继续培养１２ｈ。

然后收集细胞，用ＰＢＳ洗涤后，将细胞重悬于０．３ｍｌ　ＰＢＳ，迅速注入－２０℃预冷的７５％乙醇固定。

用ＰＢＳ洗涤去掉乙醇，将细胞重悬于０．３ｍｌ　ＰＢＳ中，加入０．６ｍｌ碘化丙啶溶液，４℃避光染色１５ｍｉｎ以上，经５０μｍ尼龙网过滤后，用ＥＰＩＣＳｃｏｕｌｔｅｒ流式细胞仪分析细胞ＤＮＡ含量，并通过Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ软件分析细胞周期。

６．体内抗肿瘤实验　将３０只Ｈ２２荷瘤小鼠随机分为三组，每组１０只。

对照组灌胃０．５ｍｌ无菌水，５ｍｇ／ｋｇ剂量组和１０ｍｇ／ｋｇ剂量组分别按５ｍｇ／ｋｇ和１０ｍｇ／ｋｇ剂量体重灌胃土贝母皂苷－Ⅱ，以上治疗每２天１次。

治疗后，每３天用游标卡尺测量肿瘤１次，记录最大径和最小径，并计算肿瘤体积。

三、统计学处理
采用ＳＰＳＳ　１１．０统计软件进行数据处理，计量数据用均数±标准差（珚ｘ±ｓ）表示，并进行方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

结果
一、土贝母皂苷－Ⅱ对ＨｅｐＧ２细胞生长的抑制效果
经土贝母皂苷－Ⅱ处理后，ＨｅｐＧ２细胞的生长受到抑制作用，且随着浓度的升高，抑制作用增强，呈明显的剂量依赖效应；半数抑制剂量（ＩＣ５０）为４．０５μｇ／ｍｌ（图１）。

图１　土贝母皂苷－Ⅱ对ＨｅｐＧ２细胞的生长抑制作用
二、土贝母皂苷－Ⅱ对细胞形态影响
ＨｅｐＧ２细胞经土贝母皂苷－Ⅱ处理后，随着浓度增大，细胞数量减少，细胞之间出现空隙；细胞形态变化，有的表面皱缩，有的变成圆球状；并且随浓度增加，这种趋势进一步明显（见内页４图２）。

三、ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳
ＨｅｐＧ２细胞经不同浓度的土贝母皂苷－Ⅱ处理，基因组ＤＮＡ呈现典型的的梯形条带，有降解的现象，并且这种趋势随着浓度的增加更加明显。

四、荧光显微镜观察
土贝母皂苷－Ⅱ处理ＨｅｐＧ２细胞并经双染色后，荧光显微镜下观察，土贝母皂苷－Ⅱ０μｇ／ｍｌ组细胞为浅蓝色，细胞核呈均匀的圆；而土贝母皂苷－Ⅱ６μｇ／ｍｌ组细胞着浅红色并可见核固缩、碎裂等典型的凋亡细胞形态（见封二图３）。

五、土贝母皂苷－Ⅱ对细胞周期的影响
流式细胞术分析显示，用土贝母皂苷－Ⅱ０、２、４、６μｇ／ｍｌ处理细胞后，Ｇ２／Ｍ期细胞数增加，Ｇ０／Ｇ１期细胞数明显减少，并且这种趋势随药物浓度增大而加强（表１）。

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江苏医药２０１２年８月第３８卷第１５期　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１２，Ｖｏｌ　３８，Ｎｏ．１５
表１　土贝母皂苷－Ⅱ对ＨｅｐＧ２细胞Ｇ
２
／Ｍ细胞周期的影响（珚ｘ±ｓ，％）
细胞分期
土贝母皂苷－Ⅱ浓度（μｇ／ｍｌ）
０　２　４　６
Ｇ１６５．９５±４．３２　６１．０７±５．９８　５３．０１±２．７６　４９．３０±３．８７
Ｓ　１５．５３±３．３４　１６．７１±２．４６　１５．０８±１．０２　１１．４６±２．７８
Ｇ２１７．５２±２．１５　２５．０８±２．２８　３２．９２±５．７８　３９．５２±２．９７
六、土贝母皂苷－Ⅱ体内抗肿瘤效果
不同剂量土贝母皂苷－Ⅱ治疗后荷瘤小鼠的相对肿瘤体积的变化如图４所示。

三组动物的肿瘤体积随着时间的延长都出现增大的趋势，从治疗后第９天开始，对照组动物肿瘤体积增大速率明显大于治疗组；第２１天时，对照组、５ｍｇ／ｋｇ组和１０ｍｇ／ｋｇ组动物的肿瘤体积分别为４７９．９、３３０．７和３１５．８ｍｍ３；第３０天时，这种趋势更加显著。

　图４　经土贝母皂苷－Ⅱ治疗后Ｈ２２肝癌小鼠模型的肿瘤
体积变化
讨论
本研究结果显示，土贝母皂苷－Ⅱ对ＨｅｐＧ２细胞均有强烈的抑制作用，且随着浓度的增大，抑制作用增强，呈明显的剂量依赖效应。

体内药效学实验也证明，土贝母皂苷－Ⅱ对肿瘤的生长有显著的抑制作用。

细胞凋亡与肿瘤发生、发展与消退有密切关系，大多数抗肿瘤药物能诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究结果显示，癌细胞经土贝母皂苷－Ⅱ处理后，数量大量减少，细胞核呈现固缩、碎裂等典型的凋亡细胞形态。

进一步研究发现，细胞ＤＮＡ呈现典型的的梯形条带，并有降解的现象。

流式细胞仪分析显示，ＨｅｐＧ２细胞经土贝母皂苷－Ⅱ处理后，细胞周期发生明显变化，Ｇ２／Ｍ期细胞数增加，Ｇ０／Ｇ１期细胞数明显减少。

以上结果均提示，土贝母皂苷－Ⅱ可能是通过使肿瘤细胞滞留于Ｇ２／Ｍ期，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

综上所述，本研究结果提示，土贝母皂苷－Ⅱ对肿瘤的生长有显著的抑制作用，而且可能是通过使肿瘤细胞滞留于Ｇ２／Ｍ期，从而改变了肿瘤细胞的分裂过程，抑制了肿瘤细胞的增殖和生长。

参考文献
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［７］　杨萍，于廷曦，马润娣，等．土贝母皂苷诱导人宫颈癌ＨｅＬａ细胞周期阻滞和细胞凋亡［Ｊ］．癌症，２００２，２１（４）：３４６－３５０．［８］　Ｃｈｅｎ　ＣＮ，Ｗｕ　ＣＬ，Ｌｉｎ　ＪＫ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｎｏｖｅｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｐｒｏｐｏｌｉｎ　Ａ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｏｌｉｎ　Ｂｆｒｏｍ　Ｔａｉｗｅｎｅｓｅ　ｐｒｏｐｏｌｉｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ，２００７，２４５（１－２）：２１８－２３１．
（收稿日期：２０１２－０１－０６）（供稿编辑：杨郁）
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·江苏医药２０１２年８月第３８卷第１５期　Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｍｅｄ　Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１２，Ｖｏｌ　３８，Ｎｏ．１５。