进行病原性细菌分离鉴定如何才能提高检出率？

熟禽：每份样品1只
部 位
香肚：每份样品1个 肉松：每份样品200g
采 取
(一)
样 品 处 理
混匀样品
➢液体样品：电动、手摇或敲打震荡
✓乳钵—研磨均匀
➢固体样品 ✓高速组织捣碎机
✓匀浆器 ✓商品化的均质器
卫生微生物样品特点
➢ 数量低—浓缩 ➢ 细菌受损—复苏 ➢ 杂菌多—选择性增菌和分离
标本 处理
❖ 采集：正确采集方法,时间、种类 ❖ 运送：温度、时间、培养基 ❖ 处理：集菌、减少杂菌 、生物过滤、
修复培养
影响样品代表性的因素
采样量
批号
GB
采样部位 采样时间
采样的随机 性和均匀性
4789.1
生肉：取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌 要
100g/只
不
肉 熟肉：酱卤制品，熏肉及灌肠取样不少 同
类
于200g，烧烤制品应取样50cm2
鉴定 报告
选择合适的分离培养方法 增加样品接种量
增加分离平板的种类
挑选多个可疑菌落进行鉴定 培养基的质量控制
二、选择合适 培养条件：温度、湿度、气体等。 如幽门螺杆菌
三、增加样品接种量 四、挑选多个可疑菌落进行鉴定
阪歧肠杆菌检验方法
滤膜：硝酸纤维素、醋酸纤维
2020/11/25
13
过滤法
2020/11/25
14
(二)样品浓缩
吸附法
➢非特异性吸附：化学制剂形成 沉淀，共沉淀细菌
➢特异性吸附：利用配体与受体 的亲和力，吸附待检微生物。
如流感病毒血凝素可与红细胞 结合，低速离心收集红细胞，即 达到浓缩病毒的目的
2020/11/25
333g样品
—FDA方法
100、10、1g样品各三份（分别溶于9份45℃无菌蒸馏水）
36℃过夜
10ml培养液 + 90ml的EE肉汤，混匀
36℃过夜
涂布法或划线法接种VRBG琼脂
36℃过夜
选择可疑菌落划线接种于TSA琼脂上
25℃48-72h
选择黄色菌落用 API 20E和氧化酶试验确证
15
(二)样品浓缩
捕获
清洗
释放
固相包被的抗体 捕获目标细菌
洗涤程序减少杂菌 用特异性酶切割抗体 以释放活菌細胞
免疫磁珠法
磁珠-抗体与抗原結合
(三) ❖修复培养
损 ➢ 微生物受到严重损伤后，一般培
伤
养方法不生长
菌 ➢ 亚致死性损伤的致病菌，普通培
的
养方法无法培养而造成假阴性
复
➢ 人类食用后有患病的潜在威胁， 当受损细菌进入人体，得到修复
➢ 再加多黏菌素B，42℃，微需氧培养
（4）大肠菌群、粪大肠菌群、副溶血弧菌、 粪链球菌和金黄色葡萄球菌的MPN测定法：
➢样品接种STB培养基，35～37℃，4～16h前增菌 ➢每管再加双料选择性肉汤培养基。再按原法进行
（5）表面覆盖平板法：
➢样品倾注无选择性营养丰富的琼脂的平板， 25～37℃，1～4h，恢复受伤菌
直 接 涂 片
ELISA
DFA
豚 鸡胚 鼠 卵黄 腹囊
分离培养 可疑菌落
染
腔
4~5天
纯培养
色
出现 症状 卵黄
腹腔液 PBS液
鉴定试验
脾悬液
DNA
染 生血气
初步报告 染 色
报告
色 化清相
镜 反学色 检 应试谱
相 关 度
验
测
定
Gimene
标本
分离培养 可疑菌落
鉴定 报告
浓缩
损伤菌的复苏
沉淀法
过滤法
吸附法
分离培养 可疑菌落
鉴定
➢酸处理
➢中和消毒剂
➢碱处理
➢沉淀
➢酶处理
➢过滤
➢消毒剂处理 ➢富集
➢加热处理 ➢生物过滤
报告
(一)样品处理
❖ 酸处理：
➢军团菌：1份样品+1份1.2mol/L酸缓冲剂， pH2.2，5min，中和后接种
➢结核分支杆菌：1份痰样品+2~4倍的4%硫酸， 室温30min，作用？
➢再依据欲计数的细菌类别，覆盖一层约10～ 12ml的选择性培养基，继续培养。按原法进行
（6）滤膜平板法：
➢混匀的样品1ml，涂布于孔径450μm的滤膜 上
➢置无选择性的琼脂平板培养基上，37℃， 4h，恢复受伤细菌
➢然后将滤膜置于选择性琼脂平板培养基上， 40℃18h，计数粪大肠菌群
标本
分离培养 可疑菌落
苏
产生致病性
(三) ❖加工食品日益增多,细菌受损因素： 损
伤
✓热
✓高渗透压
菌
✓冷冻
✓消毒剂
的
✓冷藏
✓防腐剂
复
✓干燥
✓添加剂
苏
(三) ❖修复培养方法：
损
✓ 增加营养成分：如肉浸汁、胰胨、蛋白胨、
伤
各种氨基酸、活性酶蛋白、ATP、丙酮酸 等
菌
✓ 简单的低级培养基：缓冲蛋白胨水，蛋白
的
胨、Nacl、磷酸缓冲液缓冲液等
免疫磁珠法
常用方法
沉淀法
(二)样品浓缩
细菌：离心沉淀，3000r/min,30min 差速离心：去除杂质，收集菌体 絮凝剂沉淀：FeCl3+ NaOH→Fe(OH)3↓
病毒：高速或超速离心机
过滤法
细菌：在负压或正压作用下，通过 0.45μm孔径的滤膜
病毒：通过膜的静电吸附浓缩过滤法 还可消除样品中的抑制剂
进行病原性细菌的分离鉴定 如何才能提高检出率？
标本 处理
标本
分离培养
增菌培养
或修复培养
可疑菌落 鉴定 报告
标本
分离培养 可疑菌落
采集：正确采集方法,时间、
种类
运送：温度、时间、培养基 处理：集菌、减少杂菌 、
生物过滤、修复培养
鉴定
报告
一、样品采集、运送、处理
❖ 样品的种类和来源
– 卫生指标微生物 – 病原微生物
➢ 军团菌：50℃水浴30min ➢ 炭疽杆菌：65℃水浴30min或85℃5min
(一)样品处理
❖中和消毒剂处理：
➢ 硫代硫酸钠中和含氯消毒剂，如检测 自来水的细菌，检测水标本的军团菌 等
❖生物过滤：
➢ 钩端螺旋体—小白鼠—肺 ➢ 军团菌—豚鼠—肺
快速诊断
标本 酸、热处理
酸、热处理
35℃ 2.5%CO2 3~7天
❖ 碱处理：
➢结核分支杆菌：1份痰标本+2~4倍量2%NaOH， 室温5~10min，作用？
(一)样品处理
❖酶处理：
➢ 结核分支杆菌：1份痰标本+1~2倍量的0.1%胰 蛋白酶，室温5min，作用？
❖消毒剂处理：
➢ 结核分支杆菌：1份痰标本+1/2倍量0.3%苯扎 溴胺，室温5min，作用？
❖加热处理：
复
✓ 高渗培养基、含有血清培养基
苏
✓ 无抑制剂的培养基 ✓ 改变pH
✓ 降低培养温度
损伤菌的恢复
国际上较公认的一些方法：
（1）副溶血弧菌：用3％NaCl蛋白胨水，
35℃培养2h前增菌
（2）耶尔森氏菌属：4℃培养前，先25℃
（3）弯曲杆菌：
培养4h，前增菌
➢ 样品先于0.3％琥珀酸钠、 0.01％胱氨酸-HCl 和抗生素的布氏肉汤，37℃培养6h