除了CRISPR,你还应该知道的基因编辑方法

除了CRISPR，你还应该知道的基因编辑方法

图片：Argonaute蛋白（模型如图）是潜在的CRISPR–Cas9基因编辑系统替代品之一

CRISPR–Cas9系统让科学家可以按自己的想法改造基因，由于比先前的技术更简单、成本更低、更万能，CRISPR–Cas9几乎席卷了全世界的实验室，为基础研究和医药领域寻找更多有应用价值的发现。但与贡献相对应的是，CRISPR–Cas9也有其局限性。今年中国的研究人员韩春雨发布了一套新的基因编辑系统NgAgo，让全世界的研究人员都燃起了极大的热情，因为它有望替代CRISPR–Cas9，但正如哈佛医学院的遗传学者George Church所言：这也同时提醒我们每一个新技术都很脆弱。

NgAgo也只是越来越多的基因编辑工具之一，它们有些是在CRISPR的基础上进行改变，

有些是寻找新的基因组编辑方法。本文总结了目前主流的基因剪辑技术研究方向。

1、mini-me

或许未来CRISPR-Cas9会被用来改写遗传疾病的基因，但一条RNA链和一个Cas9酶的组合太过庞大，并不适合用于目前最常用的疾病治疗——将外源基因整合到病毒上再转入人体细胞这一过程。目前的解决方案是采用一种从金黄色葡萄球菌里提取的mini-Cas9[1]，它足够小能够进入目前市场上用于基因疗法的病毒内部。去年12月，有两个研究组用mini-meCas9来修正了小鼠的杜氏肌营养不良基因[2,3]。

2、扩大剪辑范围

Cas9并不是随意剪辑基因，而是只能在有特定DNA序列的位点进行剪辑，很多基因组都能满足这个需求，但对于另一些实验就是很痛苦的限制。研究人员正在寻找能够提供剪辑不同序列的酶的微生物，这样才能扩大能够修饰的基因的范围。其中一种叫做Cpf1的酶可能会成为一种有吸引力的选择，它比Cas9小，有不同的序列要求并且高度特异[4,5]。另外一种酶C2c2，它的靶序列是RNA而不是DNA，它的潜力在于可以通过研究RNA基因组来对抗病毒[6]。

3、真正的基因编辑

很多实验室用CRISPR–Cas9都只是删除部分基因来废除某种功能，正如Church所言：“人们希望听到胜利的消息，但是烧掉一页书并不算是编辑一本书。”那些想要交换序列的研究面临的困难更大。当Cas切掉基因后，细胞通常会把断裂的序列链接起来，这就是做基因切除的研究人员们想要的。但对于想要改写基因的研究人员，他们依赖的的是另一种可以插入序列的细胞修复机制，这当然比普通的连接修复机制频率低得多。明尼苏达大学的植物学研

究人员Daniel Voytas说：“很多人都认为未来是可以编辑很多基因，但我认为我们甚至连目前这一个都做不到合理的效率。”

但过去几个月的发展给了Voytas希望，今年4月份的时候研究人员发布了一项研究结果，用失活的Cas9绑定另外一种酶，成功地改变了DNA链上特定的碱基。时候的Cas9仍然可以通过引导RNA定位到特定的DNA序列，但是不进行剪辑，由附加的酶对DNA位点进行编辑，最后把该位点的C变成了T[7]。上周《science》上发表的一篇论文也得到了类似的结果[8]。Voytas和研究人员对于通过失活的Cas9绑定其他酶这一方法充满了希望，这也许会带来不同对DNA序列的不同及改变。

4、关于Argonautes的探索

今年5月，在《Nature Biotechnology》上的一篇论文公开了一种完全全新的基因编辑系统[9]。研究人员称他们可以用NgAgo蛋白在特定的位点切断DNA序列而不需要引导RNA，也不需要附近有特定的基因序列，相反的，这种来源于细菌的蛋白质是通过一小段DNA序列匹配到目标区域的。这一发现在研究领域炸开了锅，业内纷纷猜测CRISPR–Cas9可能要被取代了，但目前还没有实验室能重复出这一结果。即便如此，仍有希望从NgAgo蛋白所属家族的其他蛋白上找到前进之路。

5、重组酶

其他的编辑系统也在研究中，虽然其中有一部分已经徘徊了多年。为了能够广泛的编辑细菌基因，Church的实验室并没有采用CRISPR系统，而是使用一种叫做lambda Red的系统，也是不需要引导RNA就可以改变DNA序列。Church的实验室已经研究了lambda Red13年，目前它只能用于细菌DNA编辑。Church和MIT的张峰教授都表示，他们的实验室在

研究整合酶和重组酶用于基因编辑。张教授说：“通过扩展酶的多样性，我们能得到更多强有力的工具，我们必须去探索未知的世界。”

以上就是目前基因编辑工具研究的主要方向。主流技术的局限性会催生对其他可能性的探索，我们也期待科学家们能够探索出更加高效的基因编辑技术。8月8日，韩春雨教授在《nature》上发布了他的实验详细步骤，希望这对于各位研究人员重复实验能有帮助，也期望尽快看到正面的结果。

原文

Beyond CRISPR: A guide to the many other ways to edit a genome. Nature 536, 136–137 (11 August 2016) doi:10.1038/536136b

参考文献

[1] Ran, F. A. et al. Nature 520, 186–191 (2015).

[2] Nelson, C. E. et al. Science 351, 403–407 (2016).

[3] Tabebordbar, M. et al. Science 351, 407–411 (2016).

[4] Kim, D. et al. Nature Biotechnol. /10.1038/nbt.3609 (2016).

[5] Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnol. /10.1038/nbt.3620 (2016).

[6] Abudayyeh, O. O. et al. Science 353, aaf5573 (2016).

[7] Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Nature 533, 420–424 (2016).

[8] Nishida, K. et al. Science /10.1126/science.aaf8729 (2016).