微胶囊技术对乳酸菌冷冻保存的研究

微胶囊技术对乳酸菌冷冻保存的研究

本实验通过向微胶囊制备过程中添加保护剂脱脂乳

粉和海藻糖，以乳酸菌的存活率为考察指标，研究保护剂对乳酸菌微胶囊冷冻干燥情况下的影响情况。首先考察了不同浓度的单一保护剂对微胶囊冷冻干燥后乳酸菌存活率的影响，然后通过正交试验找出了最佳的保护剂配比，以及能提高乳酸菌在冷冻干燥下的存活率。

实验方法

乳酸菌的活化。将实验室保藏的乳酸菌冻干粉接人到11%脱脂乳中的水溶液中，经37℃厌氧恒温培养24h，脱脂乳凝固。用无菌水稀释0.1mL凝乳，制得含乳酸菌菌悬液。对菌悬液进行平板划线分离，37℃厌氧培养24h，这样连续传代2-3次，使其充分活化。

复凝聚法制备乳酸菌微胶囊方法。（1）原胶液的制备：取明胶，用蒸馏水适量浸泡溶胀后，加热溶解；取阿拉伯胶水中加热至80℃左右，轻轻搅拌使溶解；两溶液均40℃保

温备用。（2）微囊的制备：在40℃水浴条件下，明胶溶液、乳酸菌菌悬液和适量的乳化剂（吐温-80）混合，轻轻搅拌均匀。5min后向混合液加入阿拉伯胶溶液，继续搅拌使明胶和阿拉伯胶溶液充分混合均匀，此时溶液形成稳定的水包油乳液。不断搅拌下，滴加1%醋酸溶液于混合液中，调节pH至

3.8～

4.0。（3）微囊的固化：在不断搅拌下，溶液自然冷却至30℃左右时，将其置于冰浴中，继续搅拌至温度为10℃以下，加入固化剂，继续搅拌15min，再用10%NaOH溶液调其pH8～9，继续搅拌20min，观察至析出为止，静置待微囊沉降。（4）微胶囊的收集：将固化后的微胶囊用蒸馏水进行洗涤，过筛（320目），收集。

复凝聚法制备乳酸菌微胶囊的最佳工艺条件。菌胶比例1：6，复合胶体浓度15%，凝聚pH值3.8，搅拌速度600rpm，反应时间15min，反应温度30℃。在此工艺条件下所制备微胶囊对乳酸菌的包埋率为92.5%以上，且制备得到微胶囊呈球形好，粘连性低，粒径分布均匀。

乳酸菌菌落总数的测定。（1）以无菌操作将经过充分摇匀的菌液25mL放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1：10的均匀稀释液。（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。（3）另取1mL 灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。（4）选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于事先灭菌装有MRS固体培养基的平皿内。（5）同时将1mL灭菌生理盐水于事先灭菌装有MRS固体培养基的平皿内作空白对照，以上整个操作自培

养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。（6）翻转平板，置37±1℃恒温培养箱内培养48±3h取出，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。根据该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。涂布均匀，每个稀释度作三个平皿。

乳酸菌的存活率。存活率=冻干后微胶囊里活菌数/冻干前微胶囊里的总活菌数×100%。冻干前后微胶囊里活菌数测定：精确称取冻干前后的微囊各50mg，置于100mL灭过菌的PBS缓冲液中破碎，于37℃恒温振荡24小时后，冷却至室温，过滤，取清液进行菌落计数

结果与分析

保护剂对乳酸菌微胶囊冷冻干燥的影响研究。

实验分两部分：单因素实验和正交试验。

脱脂乳粉浓度对微胶囊冷冻干燥的影响。将脱脂乳粉（0g/L，20g/L，40g/L，60g/L，80g/L）分别加入混合乳液中，制备乳酸菌微胶囊冻干品，以冷冻干燥后的乳酸菌的存活率作为考察指标，研究不同浓度的脱脂乳粉对微胶囊乳酸菌存活率的影响。

对脱脂乳粉的实验组实验数据进行单因素方差分析可知，乳酸菌微胶囊在冷冻干燥后的活菌数远高于对照组（加入脱脂乳粉为0的实验组）（P脱脂乳粉含量。单因素方差分析显示，与对照组相比，所有添加保护剂的试验中的存活率

都提高显著（P2B2即脱脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L，其A2B，所测得的乳酸菌微胶囊冷冻干燥后的活菌数为9.93×

1010cfu/g，菌存活率为96.7%，比未添加保护剂的对照组提高了近3个数量级，因此通过正交试验优化出的冷冻干燥保护剂组合能显著提高冻干胶囊的活菌数。乳酸菌微胶囊储存稳定性实验。将未微胶囊化乳酸菌（A）、未添加保护剂乳酸菌微胶囊（B）、添加保护剂乳酸菌微胶囊（C）、未添加保护剂冻干乳酸菌微胶囊（D）以及添加保护剂冻干乳酸菌微胶囊（E）一起置于冰箱中4℃冷藏条件下，测定微胶囊的存储稳定性。

随着储存时间的延长，乳酸菌的存活率均成不断下降趋势。单因素方差分析显示：所有微囊化乳酸菌实验组在低温4℃下存储60天后存活率与未微胶囊化的乳酸菌相比有显著差异（P10cfu/g。微胶囊化能使乳酸菌隔绝外部的氧环境，使其更好的存活，从而显著提高了乳酸菌在低温4℃下储存活性将微胶囊化的四组实验数据进行对比并单因素方差分析可以看出，添加保护剂冻干微胶囊和添加保护剂微胶囊在低温4℃条件下存储60天后的活菌数与未添加保护剂冻干微囊和未添加保护剂的微囊存储60天后的活菌数比较有显著差异（P10cfu/g。添加保护剂微胶囊次之，其乳酸菌的存活率仍然高达93.5%，要比未添加保护剂冻干微囊和未添加保护剂的微囊存储60天后的菌存活率高出10%左右。因此，

添加冷冻干燥保护剂不仅提高了微胶囊冷冻干燥过程中乳

酸菌的存活率，而且显著提高了微胶囊在低温4℃条件下的

存储稳定性。主要原因可能是：乳酸菌在低温下处于休眠状态，其代谢是相对静止的：保护剂的添加有助于提高乳酸菌微囊恶劣环境的抵抗能力

结论

以微胶囊冷冻干燥后乳酸菌的存活率为考察指标，研究了脱脂乳粉浓度、海藻糖浓度等因素对微胶囊冷冻干燥的影响，并对其影响机理进行了分析。然后，在单因素的基础上，选取两因素的合适水平进行正交试验，筛选出冷冻干燥后提高乳酸菌存活率的保护剂最佳浓度配比。

确定了最佳的冷冻干燥保护剂含量配比：脱脂乳粉60g/L，海藻糖20g/L。在此最佳保护剂含量配比下，所制备的微胶

囊冷冻干燥后乳酸菌存活率为96.7%，活菌数为9.93×

1010cfu/g，比未添加保护剂的对照组提高了近3个数量级。

无论是单一的保护剂还是复合保护剂都能够显著提高

乳酸菌微胶囊冷冻干燥后的活菌数，与未添加保护剂的对照组有显著差异（P10cfu/g比添加单一保护剂海藻糖的微胶囊冷冻干燥后最高乳酸菌活菌数7.81×1010cfu/g还要高出1

倍多。

不同的保护剂各有优缺点，单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣的条件。冷冻干燥过程中添加海藻糖和脱脂乳粉