泛素-蛋白酶体与蛋白酶体抑制剂

泛素-蛋白酶体及其抑制剂
沈子珒许啸声李稻审校
上海交通大学医学院病理生理学教研室
摘要：蛋白酶体与泛素化信号系统一起构成的泛素—蛋白酶体（UPP）是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系，参与和调控细胞的增殖、分化和凋亡。

蛋白酶体是一个由20S 催化颗粒、11S调控因子和2个19S调节颗粒组成的ATP依赖性蛋白水解酶复合体。

蛋白酶体的活性状态对细胞功能正常维持是非常重要的。

26S蛋白酶体对蛋白的降解依赖于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白识别。

蛋白酶体抑制剂能通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能，尤其对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。

同时，利用蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性也成为免疫、炎症等研究的热点。

蛋白酶体的抑制剂可分为天然化合物和合成化合物两类，其中Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年研究较多的一种蛋白酶体抑制剂。

关键词：肿瘤蛋白酶体泛素蛋白酶体抑制剂PS-341
泛素—蛋白酶体通路（Ubiquitin–proteasome pathway，UPP）的蛋白酶体（proteasome）是一种具有多个亚单位组成的蛋白酶复合体，蛋白酶体沉降系数为26S，故又称26S蛋白酶体。

蛋白酶体水解蛋白的前提是靶蛋白的泛素化。

在UPP中，各种靶蛋白质泛素化后，先被26S蛋白酶体的19S亚单位识别，随后泛素化靶蛋白脱泛素链和变性，进入20S亚单位的筒状结构内被降解成3~22个多肽。

由于蛋白酶体具有精确降解细胞内各种目的靶蛋白，进而参与基因转录和细胞周期调节，以及受体胞吞、抗原呈递等各种细胞生理过程[1]。

因此，应用蛋白酶体抑制剂改变其酶切位点活性已成为抗肿瘤治疗的研究热点，蛋白酶体是影响和改变细胞功能重要的目的靶标。

1．蛋白酶体组成
1979年，Goldberg等首先报道在大鼠肝脏和网织红细胞中存在一种分子质量为700 kD的受A TP激活的中性蛋白水解酶。

此后，一些在形态、功能及免疫学特征上与之相同的颗粒通过不同途径被分离出来，被统一命名为蛋白酶体[2]。

在真核生物进化中，蛋白酶体具有高度的保守性，其简单形式甚至存在于古细菌和真细菌中。

真核细胞内的蛋白酶体分布于胞质与胞核内，有的与内质网或细胞骨架相结合，约占细胞蛋白质总量的1％。

有功能的26S蛋白酶体是由20S催化颗粒（catalytic particle, CP）、11S调控因子（11S regulator）和2个19S调节颗粒（regulatory particle, RP）组成，其分子量为2.4MD，是ATP依赖性蛋白水解酶复合体。

1．120S催化颗粒（20S CP）
人类蛋白酶体CP的沉降系数为20S，分子量700~750kD。

它由α环和β环组成，每个环各有7个相同的亚单位，分别以α1-7β1-7β1-7α1-7顺序排列成圆桶状结构，20S CP中间由两个β亚单位环组成。

几乎所有β亚单位都含有一个N 端前导序列，尽管此序列在20S CP装配过程中被切除，但在引导真核生物β亚单位的正确折叠以及β与α亚单位的组装中有重要作用[3]。

当β亚单位的N端前导序列被切除后，Thr残基被暴露出来，Thr是酶的活性位点，分别存在于β环的内表面，使β亚单位具有类似的丝氨酸蛋白酶的催化作用[4]。

例如，β亚单位N端的折叠方式允许Thr的-OH对底物发动亲核反应形成半缩醛，而Thr的α-NH3可代替丝氨酸蛋白酶中His的咪唑基作为质子受体。

此外，活性位点附近的一个Lys残基与特定的丝氨酸蛋白酶中一样，也起着催化剂的作用。

目前认为，在20S CP内起催化作用的亚单位主要是β1、β2、β5。

不同的β亚单位的催化活性尽管不同，但能互相协调使蛋白酶体具有多种蛋白酶活性，如类糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like, ChTL)、类胰蛋白酶活性（trypsin-like，TL）、肽-谷氨酰肽水解酶活性（post-glutamyl-peptide hydrolyzing，PGPH）、支链氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。

在20S CP圆桶状的两端由α亚单位环组形成，环口的中央被α亚单位(α
、α2、α3、α6、α7)的N末端肽链所占据，使α环的外侧完全关闭，阻止胞内非目的靶蛋1
白质进入20S CP内，而遭到降解破坏。

不论在种间或种内，α类亚单位遗传特征均比β类亚单位更为保守。

1．211S调控因子
在哺乳动物细胞内存在参与调控蛋白酶体功能的复合物，11S调控因子（REG或PA28）是其中之一。

11S调控因子的亚单位分子量为28KD，其亚单位分为：ERGα、ERGβ、ERGγ（Ki抗原）三种。

亚单位的氨基酸序列大部分具有同源性，但17-34残基为易变区，这也赋予亚单位的特异性。

ERGα和ERGβ可优先形成一个七瓣形调控复合物—11S调控因子[5]，并结合到20S CP末端，而ERGγ不能与ERGα和ERGβ结合形成11S调控因子。

11S调控因子本身不具有催化和降解大分子蛋白的功能，但可激活蛋白酶体的蛋白酶活性，以及在促进抗原肽产生中起到重要的作用[5]。

Wilk等人认为，ERGβ低聚合体对蛋白酶体的活性有激活作用，而单体时却是蛋白酶体的强有力抑制物[6]。

1．319S调节颗粒（19S RP）
19S RP（19S调节复合物、19S帽或PA700）分别由20个亚单位组成，分子量为700KD，
位于20S CP的两端。

从酵母到人类，19S RP的多数亚单位具有高度的保守性。

19S RP形成盖部(1id)和基底部(base) 两个亚复合体。

19S RP基底部含有三倍体ATP酶亚基（RP triple ATPase, Rpt）和非A TP酶亚基（RP non- ATPase, Rpn），分子量在30~110kD之间[7]。

6个Rpt 亚基和2个Rpn亚基（Rpnl和Rpn2）组成的基底部位于CP的两侧，6个Rpt亚基直接与20SCP 的7个α亚基结合在一起共同构成蛋白酶体。

另外，Rpt有两个有特殊作用：Rpt2 ATP酶参与打开α环孔道；Rpt5 ATP酶参与识别泛素标记的蛋白质，这有利于引导展开的泛素化蛋白进入20SCP的α环内。

Strous等人认为，19S RP基底部能单独降解小分子多肽和非泛素化蛋白，盖部对蛋白酶体水解泛素化蛋白提供了高度的特异性保证[8]。

另外，Romagnani等人研究发现，在Rpnl0或Rpn9基因缺失、突变的酵母株中，盖部与基底部易发生脱落。

这提示Rpn9和Rpnl0可能具有“合页”样的接纳体(acceptor)作用[8]。

所以，完整的26S蛋白酶体对ATP依赖的泛素化蛋白降解是必须的。

2．泛素化靶蛋白识别
靶蛋白（断裂、氧化或衰老等引起的蛋白质损伤）的泛素化是26S蛋白酶体降解蛋白的前提。

但如何识别目的靶蛋白？目前为止，还知之甚少。

但有人认为，在靶蛋白的泛素化过程中，对蛋白质F-box序列的识别是识别已磷酸化靶蛋白的前提。

F-box是蛋白质间特异性相互作用的位点，具有F-box序列的蛋白质能够特异性结合磷酸化的蛋白，同时，也是泛素连接酶复合体的主要成分[ 9]。

2．1 靶蛋白泛素化
90年代初，人们发现细胞表面受体和配体结合引起的受体磷酸化与受体的泛素化降解过
程密切相关[10]。

许多细胞周期调节蛋白的泛素化受其自身磷酸化的调节，如细胞周期蛋白和细胞周期蛋白激酶的抑制蛋白、参与细胞信号传导过程的调控蛋白（表面受体、转运蛋白），以及一些转录调节因子（β-连环蛋白、P53、Jun、RNA聚合酶等）[11]。

靶蛋白的泛素化过程受遗传控制，许多蛋白都具有自身特定的泛素化所需的氨基酸序列。

Varshavsky等人首先发现重组p一半乳糖苷酶N一端存在降解决定序列，其泛素化的速度极大程度上依赖于N一端残基的同一性[12]。

此后，发现一些与泛素化降解相关序列具有亲水性特征。

但是，蛋白酶体对蛋白水解也有例外，如肿瘤抑制基因的RB蛋白能与人巨细胞病毒pp71蛋白结合在一起可通过非泛素化途径进行蛋白酶体的蛋白水解[13]。

2．2 靶蛋白脱泛素化
泛素化也是一个可逆的过程。

已经发现真核细胞内存在多种脱泛素酶(DUB)，能够水解泛素和蛋白质间的硫酯键。

DUB可分为两类：一类是泛素羧端水解酶，水解泛素C端的连接小
肽，也参与由泛素前体产生泛素单体的过程；另一类是泛素特异性加工酶，参与去除泛素化蛋白上的多聚泛素链，从而防止泛素化蛋白蓄积[13]。

当蛋白酶体功能受抑制时，泛素化蛋白水解减少，蓄积的泛素化蛋白可出现脱泛素，如泛素化c-JNK激酶水解减少时，蓄积的泛素化c-JNK激酶可过脱泛素途径使c-JNK激酶复活，结果导致c-Jun的磷酸化增加，从而增加核转录因子AP-1的DNA结合活性，使Fas表达增加[13]。

3．蛋白酶体抑制剂
由于蛋白酶体活性状态对细胞执行不同的功能是非常重要的，因此蛋白酶体将成为影响细胞功能的重要药物靶标，而其抑制剂有可能成为抗肿瘤的先导药物[14]。

实验也证实，恶性增殖细胞对蛋白酶体阻断的敏感性比非肿瘤细胞更为强烈，如乳胞素(Lactacystin)对正常的淋巴细胞无明显的作用。

Masdehors等人发现B- CLL细胞中，ChTL活性水平是正常淋巴细胞的三倍，其蛋白的泛素化水平也高于正常细胞[4]。

蛋白酶体的抑制剂可分为天然化合物和合成化合物两类。

3．1 天然化合物
3．1．1 3,4-二氯异香豆素(DCI)
DCI是丝氨酸蛋白酶的不可逆抑制剂。

近来发现，DCI也能抑制20S CP几种肽酶，如ChTL 活性。

由于DCI在抑制蛋白酶体的ChTL活性时，也能激活20S CP的酪蛋白酶活性和其他的肽酶活性，因此是一种选择性较差的抑制剂[15]。

3．1．2 乳胞素(Lactacystin)
乳胞素是链霉菌属的天然代谢物，是一种选择性的20S CP抑制剂，具有抑制细胞周期和诱导神经母细胞分化的功能。

乳胞素的活性位点可能涉及其内酰胺环上的甲基和异丁基侧链上的第二个羟基[15]。

乳胞素及其活性中间体的β-内酯可选择性和不可逆地结合于蛋白酶体的β5亚单位，从而抑制蛋白酶体多种肽酶活性，其中ChTL活性最先被抑制，TL和PGPH的活性抑制较慢，丝氨酸和酪氨酸蛋白酶活性则不受抑制。

Qiao等人发现，乳胞素可以阻止动物和人类的结肠肿瘤形成，并通过脱氧胆酸抑制p53降解，导致核内p53积聚和相应的促凋亡基因的表达[16]。

3．1．3 Aclacinomycin
Aclacinomycin是一种Aklavinone化学结构，抑制蛋白酶体的ChTL活性，对组织蛋白酶B 无抑制效应，能激活胰岛素，但对calpain作用范围较小[14]。

3．1．4Eponemycin
Eponemycin能以共价键方式结合到20S CP的β5、β5i 和β1i亚单位，选择性抑制蛋白水解酶活性，进而抑制ChTL活性。

当Eponemycin浓度上升到50 nmol/L，也不抑制其他蛋白酶（calpain、组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶、胰岛素、糜蛋白酶）的活性[14]。

3．1．5PR-39
PR-39是一种富含精氨酸/脯氨酸的多肽，它能可逆性与蛋白酶体的α7亚单位结合[14]。

3．2合成化合物
3．2．1 醛基肽
醛基肽一类蛋白酶体抑制剂，其中包括：MLN-519、MG-132、CEP- 1612、CVT-634等。

多数醛基肽抑制剂可以抑制20S CP中ChTL活性，阻止蛋白酶体对泛素化蛋白的降解。

随后研究表明，此类蛋抑制剂的P2和P3位置均为疏水性氨基酸，如Ac-Leu- Leu-Nie-H和Z-Leu- Leu-Phe-H 。

通过对Z-Leu-Leu -Xaa-H的研究表明，当P1位置为Leu或Phe（疏水性氨基酸残基）时，其抑制活性最强。

目前认为，MG-132（Z-leu-leu-leu-CHO，三肽基乙醛）作为蛋白酶体ChTL活性的可逆性抑制剂，同样也能抑制组织蛋白酶和calpains作用。

另外，Desai 等人在实验中发现，尽管MG132可以抑制喜树碱诱导的拓扑异构酶I的下调，但也能使肿瘤细胞对喜树碱的敏感性增加[17]。

He等人提出，MG132能通过上调胞膜死亡受体-5与肿瘤坏
死因子诱导的凋亡相关配体(tumor necrosis factor- related apoptosis- inducing ligand Apo2L- TRA IL)一起有效地促进Bax（－）肿瘤细胞的凋亡[18]。

近来，在HCT116细胞的实验中发现，MG132可以使肿瘤细胞停滞于G2/M期，并以剂量依赖方式抑制细胞增殖和诱导凋亡[19]。

MLN-519与β5亚基上Thr1的亲核的Oγ反应。

CEP-1612（二肽基乙醛）以可逆性加合物方式与β亚基上Thr1的亲核Oγ反应；同时，还具有抑制溶酶体和Ca2+依赖的蛋白酶活性。

3．2．2 硼酸肽（二肽硼酸衍生物）
硼酸肽是重要的蛋白酶体抑制剂。

在体外细胞和动物体内实验均表明有较强的蛋白酶体抑制活性，还具有高度的酶选择性。

Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年来研究较多的一种蛋白酶体抑制剂。

Bonezomib作用于26S蛋白酶体的催化中心，与20SCP的β亚单位环的Thr 位点结合，能有效地抑制26S蛋白酶体的蛋白水解功能，阻断UPP系统[20]。

Bonezomib通过对20S CP亚单位不同位点结合，能选择性地抑制一些特定蛋白的降解，使得细胞周期不能有序地进行，细胞周期停止于G2/M期，最终导致ADP-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase）降解、核的固缩、细胞凋亡。

Bonezomib对蛋白酶体的抑制作用是可逆的，在经过72小时处理后大多数蛋白酶体的活性都可以恢复正常。

Bortezomib也是首个用于临床研究的蛋白酶体抑制剂，在单独或联合其他药物时，显现出优越的抗肿瘤作用和用药的安全性。

最近美国食品及药品管理局（FDA）已批准Bortezomib用于治疗耐药的多发性骨髓瘤患者[21、22]。

2-aminobenzylstatine（硼酸衍生物）一个基于结构优化处理和改进的蛋白酶体抑制剂。

其中，NVP-AFB340的最具潜力靶点是ChTL，IC50值达到7nmol/L。

另外，NVP- AFD314等化合物也证实对PGPH和TL的活性有好的选择性抑制，IC50值在小于20μmol/L[14]。

3．2．3 其他
Ritonavir（HIV-1蛋白酶抑制剂）通过与20S CP的β5、β5亚单位结合，抑制ChTL活性，是一种比较弱和低分子量抑制剂。

乙烯砜三肽（三肽的乙烯砜部分）竞争性抑制物，对20S 蛋白酶体的不同β亚单位具有较强的和特异性抑制作用，但也抑制胞浆cysteine蛋白酶。

此外，金雀异黄素在体内、外实验中均证实对蛋白酶体20S CP 的ChTL活性有抑制作用[23]。

Koguchi 等人发现TMC-95A及其异构体（B、C、D）可以高选择性的抑制蛋白酶体，作用于20S CP 的ChTL、TL和PGPH活性基团[24]。

除了蛋白酶体抑制剂具有抗癌作用外，可能在抗炎症方面也显示它的作用，因为许多炎症介质也受蛋白酶体降解的影响。

因此，蛋白酶体将成为了药物发展过程中一个很具有前景的药物靶标。

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泛素-蛋白酶体及其抑制剂
Ubiquitin–proteasome and the Inhibitors
沈子珒shen zijin 许啸声xu xiaosheng 李稻li dao 审校
上海交通大学医学院病理生理学教研室
Department of Pathophysiology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine 摘要：蛋白酶体与泛素化信号系统一起构成的泛素—蛋白酶体（UPP）是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系，参与和调控细胞的增殖、分化和凋亡。

蛋白酶体是一个由20S 催化颗粒、11S调控因子和2个19S调节颗粒组成的ATP依赖性蛋白水解酶复合体。

蛋白酶体的活性状态对细胞功能正常维持是非常重要的。

26S蛋白酶体对蛋白的降解依赖于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白识别。

但蛋白酶体抑制剂能通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能，尤其对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。

同时，利用蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性也成为免疫、炎症等研究的热点。

蛋白酶体的抑制剂可分为天然化合物和合成化合物两类，其中Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年研究较多的一种蛋白酶体抑制剂。

关键词：肿瘤蛋白酶体泛素蛋白酶体抑制剂PS-341
李稻 li dao 沈子珒shen zijin 许啸声xu xiaosheng
单位：上海交通大学医学院病理生理学教研室
Institute：Department of Pathophysiology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine
通讯地址：上海市重庆南路280号邮编200025
Mailing Address：No.280, Chong-Qing South Road, Shanghai 200025, CHINA. 单位电话：(021)-776403 Title__-776403_
住宅电话：（021）手机：
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沈子珒许啸声硕士生（在读生）
李稻男上海人副教授硕士教研室副主任 973项目子课题：利用原创性细胞分化模型发现诱导分化治疗白血病的药物靶标（2002CB512806）负责人。

编辑：
您好！，得到你们的反馈，十分感谢。

沈子珒和许啸声是在读硕士学生，在上基础课期间，结合我们的研究方向写了本篇综述，可能存在不足。

我们教研室主要研究方向是肿瘤发病的分子机制和药物的靶基因探讨。

承担《基于生物信息学的药物新靶标的发现和功能研究》的国家973项目。

现按贵刊要求把材料寄出，20元审稿费通过邮局寄出。

谢谢！
上海交通大学医学院病理生理学教研室 2006．03．20。