结晶紫与蛋白质相互作用的电化学行为的研究
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实验了 pH 值对 Δip 的影响 , 结果表明 pH 在 4. 5时Δip (图 3) 最大 ,本实验选择溶液 pH4. 5 。
图 3 pH 对峰电流的影响 1. 5 ×10 - 5 molPL CV + 0. 03 molPL NaAc2HAc ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
图 1 循环伏安图 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc + 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
Baidu NhomakorabeaElectrochemical Study of the Interaction between Crystal Violet and Bovine Serum Albumin (BSA)
PENG Zhen , ZHANG Zhong2ping , XUE Jian2yue
( Department of Chemistry , Chaohu University , Anhui Chaohu 238000 , China)
Abstract : Crystal violet can react with bovine serum albumin to produce an electrochemically non2active supermolecular crystal violet2BSA in the buffer solution of NaAc2HAc (pH4. 5) . Crystal violet has well2defined first order derivative linear2sweep polarographic wave at - 0. 82 V ( vs SCE) . Adding BSA into the crystal violet solution results in decrease of peak current without any change of peak potential . The decrease of peak current is proportional to BSA concentration from 0. 5 to 35 mgPL. The limit of detection is 0. 2 mgPL , and the correlation coefficient is 0. 998. This method can be applied to determine BSA concentration. Key words : crystal violet ; BSA ; linear sweep polarography
收稿日期 :2005204210 ;修回日期 :2005212220 作者简介 :彭 贞 (1974～) ,女 ,安徽巢湖人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事电分析化学研究 。E2mail :pengzhen310 @sina. com
第2期
化 学 世 界
·79 ·
仪器厂) 。 牛血清白蛋白 (BSA ,武汉生命技术有限公司 ,
0. 998 0. 997 0. 994
2. 5 干扰物质的影响 实验了酪氨酸 ,L2胱氨酸 ,丝氨酸 ,谷氨酸 ,柠檬
酸 ,苹果酸及金属离子如 Zn2 + ,Fe2 + ,Ca2 + 等 ,结果表 明低浓度的上述物质对测定结果影响不大 。 2. 6 极谱波性质 2. 6. 1 峰电流与扫速的关系
图 4 缓冲液用量的影响 1. 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
2. 3. 2 结晶紫用量对反应体系的影响 在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 的缓冲液中 ,固定 BSA
浓度为 10 mgPL ,考察结晶紫浓度变化对测定的影 响 ,结果表明 ,当结晶紫浓度为 5 ×10 - 5 molPL 时 ,峰 电流稳定 ,且峰电流差值Δip (图 5) 最大 ,所以本实 验选择结晶紫浓度为 5 ×10 - 5 molPL 。 2. 4 稳定性实验
图 2 单扫描极谱图
1. 0. 03 molPL NaAc2HAc + 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
2. 2 单扫描极谱曲线 如图 2 所示 ,在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 缓冲液中 ,
用线性扫描一阶导数极谱法对体系进行测定 ,结晶 紫在 - 0. 82 V ( vs SCE) 处有一灵敏一阶导数还原 峰 ,当在溶液中加入一定量的 BSA 后 ,峰电位不变 而峰电流却明显降低 , 峰电流的降低值同加入的 BSA 的量在一定范围内呈线性关系 ,因此可以用于 BSA 的电化学测定 。 2. 3 实验条件的选择 2. 3. 1 缓冲介质和酸度的选择
实验表明反应 5 min 后峰电流基本稳定 ,并至 少可稳定 2 h 以上 ,本实验选取反应时间为 5 min 。 2. 5 不同蛋白质响应及工作曲线
在选定的最佳条件下 ,测定 BSA 的线性范围为 0. 5～35 mgPL ,回归方程为Δip ( nA) = 38. 7 + 728. 84 CBSA ( mgPL ) , 检 出 限 为 0. 2 mgPL 。对 7. 5 mgPL 的 BSA 溶液平行进行 11 次平行测定 ,其相对标准偏差
图 5 结晶紫用量的影响 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
表 1 不同蛋白质的标准工作曲线
蛋白质
标准工作曲线方程
线性范围 相关系数 Pmg·L - 1 rPn = 10
BSA Δip (nA) = 38. 7 + 728. 84 CBSA (mgPL) 0. 5～35 HSA Δip (nA) = 172. 3 + 694. 1 CHSA (mgPL) 0. 5～30 Lyso Δip (nA) = 79. 4 + 211. 2 CLyso (mgPL) 1. 0～25
相对分子质量以 65000 计) : 500 mgPL ,4 ℃冰箱冷 藏 ;结晶紫 (CV) 标准溶液 :5 ×10 - 4 molPL ,NaAc2HAc 缓冲液 :0. 2 molPL ,实验用水为三次蒸馏水 ,所用试 剂均为分析纯 。 1. 2 实验方法
在 10 mL 比色管中 ,依次加入 1. 5 mL ,pH4. 5 , 0. 2 molPL 的 NaAc2HAc 缓冲液 ,1. 0 mL 的 5 ×10 - 4 molPL的结晶紫溶液和一定量的 BSA ,用水稀释至刻 度 ,静置 5 min 后用电化学方法进行研究和测定 。 2 结果与讨论 2. 1 循环伏安图的变化
试验了 NaAc2HAc ,B2R 缓冲液 ,六次甲基四胺 等缓冲液对峰电流差值Δip 的影响 ,试验表明 ,结晶 紫在 NaAc2HAc 缓冲液中峰形稳定且引入 BSA 后峰 电流下降明显 ,故选之为缓冲体系 。在 10 mL 测定 溶液中 ,0. 2 molPL NaAc2HAc 缓冲液用量在 1. 0～3. 0 mL 之间变化时 ,对Δip 的影响不大 (图 4) ,取 1. 5 mL 是峰电流最稳定 ,所以本实验选用 NaAc2HAc 缓 冲液加入量为 1. 5 mL 。
2. 6. 2 电毛细管曲线 分别测定缓冲底液 (图 7 ,1) ,缓冲底液 + 结晶
紫 (图 5 ,2) ,缓冲底液 + 结晶紫 + BSA 体系 (图 7 ,3) 的电毛细管曲线 ,由图可知曲线 2 明显比曲线 1 下
图 7 电毛细管曲线 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc ;2. 1 + 5 ×10 - 5 molPL CV ;3. 2 + 7. 5 mgPL BSA
·78 ·
化 学 世 界
2006 年
结晶紫与蛋白质相互作用的电化学行为的研究
彭 贞 3 , 张忠平 , 薛建跃
(巢湖学院化学系 ,安徽 巢湖 238000)
摘 要 :结晶紫 (CV) 是一种三苯甲烷类染料 ,常用作生物染色剂和无机离子的显色剂 ,在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 缓冲液中结晶紫与蛋白质能够相互作用形成复合物 ,使结晶紫在 - 0. 82 V ( vs SCE) 处的 极谱还原峰峰电流下降 ,在最佳条件下 ,峰电流的下降值同牛血清白蛋白 (BSA) 的浓度在 0. 5～35 mgPL 范围内呈线性关系 ,其线性回归方程为Δip = 38. 7 + 728. 84 CBSA ,相关系数 r = 0. 998 ( n = 10) , 检出限为 0. 2 mgPL 。可将该方法应用于血清样品的测定 ,结果满意 。 关键词 :牛血清白蛋白 ;结晶紫 ;线扫极谱法 中图分类号 :O 646 文献标识码 :A 文章编号 :036726358 (2006) 02278203
在 150～600 mVPs 范围内 ,结晶紫和结晶紫 + BSA 的峰电流 ( ip ) 与扫速 ( v) 之间均呈线性关系 (图 6) ,相关系数分别为 0. 9993 ,0. 9998 ,说明极谱波性 质为吸附波 。
图 6 峰电流与扫速的关系 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc + 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
蛋白质结合形成一种复合物 ,使结晶紫的还原峰峰 电流降低 ,因此建立了一种新的测定蛋白质的电化 学探针 ,结果满意 。 1 实验部分 1. 1 仪器与试剂
J P2303 型极谱分析仪 (成都仪器厂) ,三电极系 统 。滴汞电极为工作电极 ,饱和甘汞电极 ( vs SCE) 为参比电极 ,铂丝电极为对电级 ; CV250W 电化学分 析仪 (美国 BAS 公司) ,JM21 型悬汞电极 (江苏电分 析仪器厂) 为工作电极 ;pHS225 型酸度计 (上海雷磁
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化 学 世 界
2006 年
为 1. 6 %。同时试验了体系对人血清白蛋白 ( HSA) 和溶菌酶 (Lyso) 的响应并制定相应的标准工作曲线 (表 1) 。由表中数据可知本方法对不同种类的蛋白 质都有响应 ,因此可用于测定血清样品中总蛋白的 含量 。
降 ,说明结晶紫在电极上有较强的吸附性 ,在体系中 加入 BSA 后得曲线 3 ,3 比 2 明显上升 ,说明结晶紫 与 BSA 形成的复合物在电极上的吸附性比游离结 晶紫的吸附性弱很多 ,并且对游离结晶紫的吸附作 用影响很小 ,复合物的形成使得溶液中游离的结晶 紫浓度降低 ,因而引起吸附电流的降低 。
2. 7 人血清样品中蛋白质含量的分析 取人血清样品 (由巢湖第一人民医院提供) 0. 1
mL 至 100 mL 的容量瓶中 ,用三次蒸馏水定容 ,存于 4 ℃冰箱备用 。取人血清样品 1 mL 按实验方法测 定同时做回收率实验 。结果见表 2 。与经典的考马 斯亮蓝法 (CBB G2250) [1] 结果一致 ,方法的回收率较 好 ,结果满意 。
蛋白质是生物最重要的基本组成成分之一 ,是 与营养 、免疫 、新陈代谢 、生命的起源和进化等都息
息相关的 ,因此蛋白质的定量测定在生命科学 、临床 医学和化学研究中占有十分重要的地位 。目前蛋白
质定量分析的方法很多 ,主要的有基于染料2蛋白质 结合及金属离子 —染料 —蛋白质结合的光谱分析 法 ,荧光分析法和共振光散射法[1～5] 等 ,利用电化学 方法研究有机分子与蛋白质相互作用及其分析应用 也有报道[6～8] 。结晶紫是一种三苯甲烷类染料 ,常 用作生物染色剂和无机离子的显色剂[9] 。经研究发 现结晶紫具有极谱活性 ,并且在弱酸性条件下能与
在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 缓冲液中 ,结晶紫有一 灵敏的不可逆还原峰 (图 1 曲线 1) ,当加入 BSA 后 , 结晶紫还原峰峰电流明显下降 (图 1 曲线 2) 。这说 明 BSA 与结晶紫结合生成一种非电活性复合物 ,降 低了结晶紫在溶液中的浓度 ,使相应的还原峰峰电 流下降 。
图 3 pH 对峰电流的影响 1. 5 ×10 - 5 molPL CV + 0. 03 molPL NaAc2HAc ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
图 1 循环伏安图 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc + 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
Baidu NhomakorabeaElectrochemical Study of the Interaction between Crystal Violet and Bovine Serum Albumin (BSA)
PENG Zhen , ZHANG Zhong2ping , XUE Jian2yue
( Department of Chemistry , Chaohu University , Anhui Chaohu 238000 , China)
Abstract : Crystal violet can react with bovine serum albumin to produce an electrochemically non2active supermolecular crystal violet2BSA in the buffer solution of NaAc2HAc (pH4. 5) . Crystal violet has well2defined first order derivative linear2sweep polarographic wave at - 0. 82 V ( vs SCE) . Adding BSA into the crystal violet solution results in decrease of peak current without any change of peak potential . The decrease of peak current is proportional to BSA concentration from 0. 5 to 35 mgPL. The limit of detection is 0. 2 mgPL , and the correlation coefficient is 0. 998. This method can be applied to determine BSA concentration. Key words : crystal violet ; BSA ; linear sweep polarography
收稿日期 :2005204210 ;修回日期 :2005212220 作者简介 :彭 贞 (1974～) ,女 ,安徽巢湖人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事电分析化学研究 。E2mail :pengzhen310 @sina. com
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仪器厂) 。 牛血清白蛋白 (BSA ,武汉生命技术有限公司 ,
0. 998 0. 997 0. 994
2. 5 干扰物质的影响 实验了酪氨酸 ,L2胱氨酸 ,丝氨酸 ,谷氨酸 ,柠檬
酸 ,苹果酸及金属离子如 Zn2 + ,Fe2 + ,Ca2 + 等 ,结果表 明低浓度的上述物质对测定结果影响不大 。 2. 6 极谱波性质 2. 6. 1 峰电流与扫速的关系
图 4 缓冲液用量的影响 1. 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
2. 3. 2 结晶紫用量对反应体系的影响 在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 的缓冲液中 ,固定 BSA
浓度为 10 mgPL ,考察结晶紫浓度变化对测定的影 响 ,结果表明 ,当结晶紫浓度为 5 ×10 - 5 molPL 时 ,峰 电流稳定 ,且峰电流差值Δip (图 5) 最大 ,所以本实 验选择结晶紫浓度为 5 ×10 - 5 molPL 。 2. 4 稳定性实验
图 2 单扫描极谱图
1. 0. 03 molPL NaAc2HAc + 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
2. 2 单扫描极谱曲线 如图 2 所示 ,在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 缓冲液中 ,
用线性扫描一阶导数极谱法对体系进行测定 ,结晶 紫在 - 0. 82 V ( vs SCE) 处有一灵敏一阶导数还原 峰 ,当在溶液中加入一定量的 BSA 后 ,峰电位不变 而峰电流却明显降低 , 峰电流的降低值同加入的 BSA 的量在一定范围内呈线性关系 ,因此可以用于 BSA 的电化学测定 。 2. 3 实验条件的选择 2. 3. 1 缓冲介质和酸度的选择
实验表明反应 5 min 后峰电流基本稳定 ,并至 少可稳定 2 h 以上 ,本实验选取反应时间为 5 min 。 2. 5 不同蛋白质响应及工作曲线
在选定的最佳条件下 ,测定 BSA 的线性范围为 0. 5～35 mgPL ,回归方程为Δip ( nA) = 38. 7 + 728. 84 CBSA ( mgPL ) , 检 出 限 为 0. 2 mgPL 。对 7. 5 mgPL 的 BSA 溶液平行进行 11 次平行测定 ,其相对标准偏差
图 5 结晶紫用量的影响 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
表 1 不同蛋白质的标准工作曲线
蛋白质
标准工作曲线方程
线性范围 相关系数 Pmg·L - 1 rPn = 10
BSA Δip (nA) = 38. 7 + 728. 84 CBSA (mgPL) 0. 5～35 HSA Δip (nA) = 172. 3 + 694. 1 CHSA (mgPL) 0. 5～30 Lyso Δip (nA) = 79. 4 + 211. 2 CLyso (mgPL) 1. 0～25
相对分子质量以 65000 计) : 500 mgPL ,4 ℃冰箱冷 藏 ;结晶紫 (CV) 标准溶液 :5 ×10 - 4 molPL ,NaAc2HAc 缓冲液 :0. 2 molPL ,实验用水为三次蒸馏水 ,所用试 剂均为分析纯 。 1. 2 实验方法
在 10 mL 比色管中 ,依次加入 1. 5 mL ,pH4. 5 , 0. 2 molPL 的 NaAc2HAc 缓冲液 ,1. 0 mL 的 5 ×10 - 4 molPL的结晶紫溶液和一定量的 BSA ,用水稀释至刻 度 ,静置 5 min 后用电化学方法进行研究和测定 。 2 结果与讨论 2. 1 循环伏安图的变化
试验了 NaAc2HAc ,B2R 缓冲液 ,六次甲基四胺 等缓冲液对峰电流差值Δip 的影响 ,试验表明 ,结晶 紫在 NaAc2HAc 缓冲液中峰形稳定且引入 BSA 后峰 电流下降明显 ,故选之为缓冲体系 。在 10 mL 测定 溶液中 ,0. 2 molPL NaAc2HAc 缓冲液用量在 1. 0～3. 0 mL 之间变化时 ,对Δip 的影响不大 (图 4) ,取 1. 5 mL 是峰电流最稳定 ,所以本实验选用 NaAc2HAc 缓 冲液加入量为 1. 5 mL 。
2. 6. 2 电毛细管曲线 分别测定缓冲底液 (图 7 ,1) ,缓冲底液 + 结晶
紫 (图 5 ,2) ,缓冲底液 + 结晶紫 + BSA 体系 (图 7 ,3) 的电毛细管曲线 ,由图可知曲线 2 明显比曲线 1 下
图 7 电毛细管曲线 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc ;2. 1 + 5 ×10 - 5 molPL CV ;3. 2 + 7. 5 mgPL BSA
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结晶紫与蛋白质相互作用的电化学行为的研究
彭 贞 3 , 张忠平 , 薛建跃
(巢湖学院化学系 ,安徽 巢湖 238000)
摘 要 :结晶紫 (CV) 是一种三苯甲烷类染料 ,常用作生物染色剂和无机离子的显色剂 ,在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 缓冲液中结晶紫与蛋白质能够相互作用形成复合物 ,使结晶紫在 - 0. 82 V ( vs SCE) 处的 极谱还原峰峰电流下降 ,在最佳条件下 ,峰电流的下降值同牛血清白蛋白 (BSA) 的浓度在 0. 5～35 mgPL 范围内呈线性关系 ,其线性回归方程为Δip = 38. 7 + 728. 84 CBSA ,相关系数 r = 0. 998 ( n = 10) , 检出限为 0. 2 mgPL 。可将该方法应用于血清样品的测定 ,结果满意 。 关键词 :牛血清白蛋白 ;结晶紫 ;线扫极谱法 中图分类号 :O 646 文献标识码 :A 文章编号 :036726358 (2006) 02278203
在 150～600 mVPs 范围内 ,结晶紫和结晶紫 + BSA 的峰电流 ( ip ) 与扫速 ( v) 之间均呈线性关系 (图 6) ,相关系数分别为 0. 9993 ,0. 9998 ,说明极谱波性 质为吸附波 。
图 6 峰电流与扫速的关系 1. 0. 03 molPL NaAc2HAc + 5 ×10 - 5 molPL CV ;2. 1 + 7. 5 mgPL BSA
蛋白质结合形成一种复合物 ,使结晶紫的还原峰峰 电流降低 ,因此建立了一种新的测定蛋白质的电化 学探针 ,结果满意 。 1 实验部分 1. 1 仪器与试剂
J P2303 型极谱分析仪 (成都仪器厂) ,三电极系 统 。滴汞电极为工作电极 ,饱和甘汞电极 ( vs SCE) 为参比电极 ,铂丝电极为对电级 ; CV250W 电化学分 析仪 (美国 BAS 公司) ,JM21 型悬汞电极 (江苏电分 析仪器厂) 为工作电极 ;pHS225 型酸度计 (上海雷磁
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为 1. 6 %。同时试验了体系对人血清白蛋白 ( HSA) 和溶菌酶 (Lyso) 的响应并制定相应的标准工作曲线 (表 1) 。由表中数据可知本方法对不同种类的蛋白 质都有响应 ,因此可用于测定血清样品中总蛋白的 含量 。
降 ,说明结晶紫在电极上有较强的吸附性 ,在体系中 加入 BSA 后得曲线 3 ,3 比 2 明显上升 ,说明结晶紫 与 BSA 形成的复合物在电极上的吸附性比游离结 晶紫的吸附性弱很多 ,并且对游离结晶紫的吸附作 用影响很小 ,复合物的形成使得溶液中游离的结晶 紫浓度降低 ,因而引起吸附电流的降低 。
2. 7 人血清样品中蛋白质含量的分析 取人血清样品 (由巢湖第一人民医院提供) 0. 1
mL 至 100 mL 的容量瓶中 ,用三次蒸馏水定容 ,存于 4 ℃冰箱备用 。取人血清样品 1 mL 按实验方法测 定同时做回收率实验 。结果见表 2 。与经典的考马 斯亮蓝法 (CBB G2250) [1] 结果一致 ,方法的回收率较 好 ,结果满意 。
蛋白质是生物最重要的基本组成成分之一 ,是 与营养 、免疫 、新陈代谢 、生命的起源和进化等都息
息相关的 ,因此蛋白质的定量测定在生命科学 、临床 医学和化学研究中占有十分重要的地位 。目前蛋白
质定量分析的方法很多 ,主要的有基于染料2蛋白质 结合及金属离子 —染料 —蛋白质结合的光谱分析 法 ,荧光分析法和共振光散射法[1～5] 等 ,利用电化学 方法研究有机分子与蛋白质相互作用及其分析应用 也有报道[6～8] 。结晶紫是一种三苯甲烷类染料 ,常 用作生物染色剂和无机离子的显色剂[9] 。经研究发 现结晶紫具有极谱活性 ,并且在弱酸性条件下能与
在 pH4. 5 的 NaAc2HAc 缓冲液中 ,结晶紫有一 灵敏的不可逆还原峰 (图 1 曲线 1) ,当加入 BSA 后 , 结晶紫还原峰峰电流明显下降 (图 1 曲线 2) 。这说 明 BSA 与结晶紫结合生成一种非电活性复合物 ,降 低了结晶紫在溶液中的浓度 ,使相应的还原峰峰电 流下降 。