纤维素酶的研究概述

纤维素酶的研究概述
摘要：由于纤维素酶对地球上广泛存在的纤维素具有水解作用，已经被应用于越来越多的领域。

纤维素酶是多酶体系，它由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶三种组分组成，三种组分协同作用才能降解纤维素。

不同菌种分泌的纤维素酶的三种组分比例不同，故其在发挥作用是的活性也有很大区别。

因此，纤维素酶高产菌种的选育非常重要，主要手段有常规理化诱变、基因重组技术、基因定位突变技术、细胞融合技术。

其在工业上主要采用液态发酵生产。

关键字：纤维素酶菌种选育液态发酵
1纤维素酶简介
纤维素酶是一种对纤维素大分子的水解具有特殊催化作用的活性蛋白质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。

其外观为灰白色的无定形粉末或液体；最适作用温度为40℃~55℃；反应最适PH值为4.0~6.0；在40℃~70℃以下稳定存在；溶于水，几乎不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂；该酶催化效率高，比一般酶高106~107倍。

自1906年Seillere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，现在纤维素酶已被广泛应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域[1]。

食品方面，纤维素酶被应用于果实和蔬菜加工、油料作物加工、茶叶加工、酒精生产、啤酒生产、食醋酿造、酱油酿造等生产工艺。

在饲料工业中，纤维素酶用来制备低纤维饲料、饲料酶制剂、水解植物纤维生产饲料酵母。

在纺织工业中，纤维素酶被用于纤维改性，真丝脱胶，染整的退浆、精炼、整理加工等方面。

纤维素酶还被用于解决“白色污染”问题。

纤维素酶用于造纸工业，利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，可以提高纸张的光洁度[2]。

纤维素酶在自然界分布极为广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶[3]。

反刍动物的瘤胃以及猪大肠也有分解纤维素的细菌存在。

纤维素酶的来源主要有三方面：植物、动物和微生物。

纤维素酶虽然在植物中广泛存在，且在植物发育的某些阶段发挥着水解细胞壁的作用，如果实成熟、蒂柄脱落等，但从植物中提取纤维素酶比较困难，且含量不高。

很多食木性的动物及食草动物之所以可以以植物为食物来源，主要是因为其体内存在内源性
的纤维素酶，但是依靠这类动物来进行工业化大规模生产也比较困难。

工业化纤维素酶的生产主要采用微生物来进行。

据不完全统计，20世纪60年代以来国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约有53个属的几千个菌种。

由于放线菌纤维素酶的产量极低，所以研究很少。

细菌纤维素酶产量也不高，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素没有降解活性，且所产生的酶是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，所以工业上很少采用细菌作为生产菌株[4]。

目前用于生产纤维素酶的微生物较多的是丝状真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，以木霉属菌种居多，较为典型的有里氏木霉、绿色木霉、康氏、木霉。

2纤维素酶的组成与功能
1933年Grassman从一种真菌产生的纤维素酶系中分辨出两个组分。

1950年，Resse等提出了著名的“C1-C x”假说[5]来阐述纤维素酶的作用方式，该假说的主要观点为：纤维素酶是一个三组分的混合物，分别命名为C1酶、C x酶和β-葡萄糖苷酶。

它们对纤维素的作用方式不同，C1酶作用于纤维素的结晶区，使之转变为可被C x酶作用的形式；C x酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的β-1，4-寡聚物；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖。

在水解天然纤维素（高结晶纤维素）时，C1酶和C x酶是分阶段协调作用的，将已转化成无定形纤维素的部分水解为水溶性产物。

“C1-C x”假说的提出引起了各国科学家对纤维素酶基础研究的极大兴趣。

上世纪六十年代以来由于分子筛和离子交换树脂等技术的应用，纤维素酶的多组分性质得到了证实。

但是，Resse等提出的C1酶和C x酶分阶段水解纤维素的设想，即C1、C x以及β-葡萄糖苷酶必须同时存在方能水解天然纤维素在以后的实验中并未获得证实，因为若先用C1酶与底物（结晶纤维素）作用，然后将C1酶与底物分开再加入C x酶，其结果并不能将结晶纤维素水解。

Wood等人以及我国的微生物工作者分离鉴定了C1酶，改变了C1酶的非水解作用的概念。

认为C1酶是一种水解酶，它不易作用于羧甲基纤维素，而能作用于结晶纤维素、磷酸膨胀纤维素等，主要产物是纤维二糖，因而证明C1酶基本上是一种β-1，4-葡聚糖纤维二糖水解酶。

Nisizawa等人发现C x酶降低棉花聚合度的速度比C1酶快得多，因此认为
C x酶先作用于纤维素，产生聚合度较低的碎片，C1酶从这些碎片末端开始将其水解成可溶性糖。

从这个意义而言，认为Reese等的“C1-C x”假说应该颠倒过来，变为“C x -C1”假说。

1980年以来，随着分子生物学的发展，人们对纤维素的研究取得了突破性进展，纤维素酶的作用方式也逐渐明朗。

近期研究认为，C1、C x都是水解酶，而且是包含多种异构酶的水解酶。

为了避免混淆Reese和Nisizawa提出的两种截然相反的C1和C x酶的概念，将这两种酶根据各自的作用方式重新命名为，内切葡聚糖酶（Endoglucanases，缩写为EG，又称CMC酶）和外切葡聚糖纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolases，缩写为CBH）。

EG作用于纤维素纤维内部的非结晶区，随机水解β-1 ,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。

CBH从纤维素链的末端作用，每次切下一个纤维二糖单元。

β-葡萄糖苷酶（BG）将上述两种酶水解产生的纤维二糖和短链的纤维寡糖进一步分解为葡萄糖。

纤维素的完全降解需要这三种酶的协同作用[6]。

不同菌株分泌的纤维素酶的三种组分的比例都不相同。

对于同种菌株，在不同的底物诱导下，不同的培养基，不同的值，不同的温度等生长条件下,它所分泌的纤维素酶的三种组分比例也不相同。

3 纤维素酶的菌种选育
纤维素酶的大规模工业化生产，需要降低纤维素酶的生产成本，所以新的高产菌株的选育是科学研究的一个重要课题。

纤维素酶高产菌株的选育手段主要有常规理化诱变、基因重组技术、基因定位突变技术、细胞融合技术。

常规理化诱变：虽然存在着偶然性大，不能定向及工作量大等不足，但在纤维素酶微生物的遗传改造上依然为一种有效手段。

从纤维素酶的研究历史来看，现在使用的许多高酶活菌株都是通过该方法获得的。

美国Rutergs[7]大学研究组（1979）在微生物遗传调控分析的基础上设计的筛选抗阻遏代谢纤维素酶微生物突变体的方法，为常规理化诱变减少了很多盲目性。

并且在他们的研究工作中发现突变株的滤纸酶活和可溶性蛋白均很大程度上超过了出发菌株。

国内中科院微生物研究所董志扬等[8]（2000）用康宁木霉通过γ射线和亚硝基胍交替处理诱变出一株纤维素酶高产菌株T801，比出发菌株产酶能力提高1.77倍；张苓花等（1998）采用康宁木霉W-925、J-931，经过浓度为2%硫酸二
乙酯和紫外线（15W、30cm、2min）复合诱变得到了产酶活性高的菌种。

产纤维素酶菌菌种易退化，退化后其产酶力明显下降，其原因可能有三个方面：经诱变筛选的菌种发生回复突变；自然负突变；菌种长时间低温斜面保藏会在分生孢子上长出次生菌丝，而次生菌丝所形成的分生孢子生命力弱，这可能是菌种退化的主要原因。

因此，选择合适的菌种保藏方法可减缓菌种退化速度。

基因重组技术：纤维素酶基因克隆是以得到纤维素酶过量生产为主要目的而进行的。

此类研究工作起始于20世纪70年代末，80年代在国外已有约80个组分的基因被克隆，但表达、分泌均很弱。

由此逐渐转向应用基因工程方法组建有新特性的纤维素酶分子[9]。

十几年来基因重组技术发展迅猛，纤维素酶系中的一些基因已在20多种细菌和真菌中克隆并在大肠杆菌或其它受体菌中得到表达。

这些工作为我们了解纤维素酶基因的遗传背景，进而构建高活性的菌株奠定了良好的基础。

酶基因重组的工作主要集中在细菌纤维素酶。

Kim[10]等克隆AquifexaeolicusVFS编码EG的ec18Y基因，在.E.coliXLl-Blue中表达成功，酶CEL8Y可耐80℃的高温。

一般克隆子的检测主要由CMC加刚果红显色检出，但这样会影响外切葡萄糖昔酶基因，以及在纤维素降解中不直接起催化作用的酶的基因克隆子检出。

因此，Kluepfel建议应该选择更多的检出底物及克隆子的检出方法。

纤维素酶基因克隆受体菌目前主要是大肠杆菌，虽然.E.coli作为受体菌有其公认的优点，但是由于该菌很少分泌蛋白质，因此现在许多学者把受体菌的工作转移到枯草芽抱杆菌(B.Subtills)、酿酒酵母（S.Cerevisiae）、乳糖发酵杆菌（Brevibacterium Lactofermentum)等。

近年来真菌纤维素酶基因克隆的工作报道不断增加。

最早的报告始于1983年Shoemaker和Teeri[11]他们分别在不同的实验室进行了Teresi外切纤维二糖水解酶工基因的克隆。

他们先制备反转录DNA探针，引入噬菌体构建木霉的基因文库，再用鉴别杂交进行筛选，然后用mRNA 杂交选择和DNA序列分析鉴定CBH1基因。

其不同之处只是所选择菌株有所不同，结果有所差别，但都分别取得了进展，使得纤维素酶基因克隆的工作从细菌扩展到真菌，从内切酶基因扩展到外切酶基因。

基因定位突变技术：基因定位突变技术工作起步于八十年代中后期。

为了有效地完成基因定位突变，必须了解纤维素酶蛋白质三维结构的活性部位，以便有效地在基因水平上改变活性部位氨基酸残基的密码子，进而改变纤维素酶的活
性。

目前已提出了3种主要应用于确定纤维素酶活性的方法，即与标记试剂的亲合性能、特定的化学修饰、以及分析纤维素酶与抑制剂及底物结合后的三维构象。

其中后者比较困难，主要由于很难得到纤维素酶的晶体，因而无法通过X-衍射分析其三维构象。

最早对T.reesi exoi基因定位突变研究始于1987年chen的工作。

目前该技术己被系统地应用于许多纤维素酶的改造中，并已有提高纤维素酶热稳定性的多篇成功报道。

细胞融合技术：通过细胞工程提高纤维素酶活性的工作始自日本外山信男（H.tayama）等学者。

他们利用原生质体融合技术研究.T.reesi的遗传，所选择的两个亲本菌株为QM9414等，其融合率为0.9-4*10-4，得到的融合子其稳定的羧甲基纤维素酶（CMCase）活性比亲本高l倍，后来工作进一步扩大到不同种木酶之间的融合。

国内在纤维素酶微生物原生质的制备、再生以及融合也都进行了探索。

4纤维素酶的生产工艺
要获得较高的酶产量，发酵方法也是非常重要的。

纤维素酶的生产主要有固态发酵和液态发酵两种方式。

固态发酵虽有设备简单、投资少的优点，但发酵水平不稳定、生产效率低、易污染杂菌、不适于大规模生产；而液态深层发酵由于具有培养条件容易控制、不易染杂菌、生产效率高等优点，已成为国外重要的研究和开发工艺[12]。

液体发酵生产工艺过程是将玉米秸杆等纤维材料粉碎到20目以下后进行灭菌处理，送发酵罐内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70h，温度控制低于60℃，采用净化后的无菌空气从罐底通入进行物料的气流搅拌，发酵完的物料经压滤机压滤、超滤浓缩，喷雾干燥，制得纤维素酶产品。

液体发酵法动力消耗大，设备要求高，但原料利用率高，生产条件易控制，产量高，劳动强度小，产品质量稳定。

随着市场的成熟，液体发酵工艺的发展以及菌种性能的提高，采用液体发酵生产纤维素酶是必然趋势。

日本过去多用固体发酵生产，后来由于这种方法难于监控，某些组分常常吸附于固体残余物上，增加了提取难度，不利于现代化流水作业，于是不少改为液体深层发酵。

美国一直都是使用液体深层发酵方法，并在此基础上出现了分批发酵法、连续发酵法、二次发酵法以及细胞循环法等等，大大提高了酶活，降低了成本。

近十几年来，纤维素酶的固定化研究成为了该领域的一个热点。

虽然大部分工作还停留在实验室和中试阶段，但取得的成就还是令人鼓舞的。

实践证明纤维素酶的固定化是提高素酶使用效率、降低生产成本的一种十分有效的方法。

尤其是在纤维素酶固定化基础上发展起来的固定菌体生长细胞的技术，会因其特有的实用优点，将成为今后纤维素酶领域的主要研究方向之一[13]。

夏黎明等采用多孔塑料吸附固定在里氏木霉菌丝细胞，以硫酸盐纸浆为底物，重复分批发酵生产纤维素酶，该方法经济、简便，易于扩大，具有明显的优越性。

固定化菌丝细胞可以在载体上保持一定的动态平衡，产酶能力稳定，至少可连续使用40天。

在固定化细胞产酶过程中，诸如产酶周期、pH值等因子的变化规律与游离细胞发酵基本相似，但酶活力明显提高，而且粗酶液中游离菌丝很少。

固定化菌丝生产的酶液对木质纤维原料的降解能力很强。

当每克底物的酶用量为滤纸酶活力151U/时，酶解得率可达86%；酶用量在20IU以上时，酶解得率可达90%以上。

固定化酶与水溶性酶相比，具有下列优点：(1)极易将纤维素酶与底物、产物分开；(2)可在较长时间内反复进行分批反应和装柱连续反应；(3)可提高纤维素酶的稳定性；(4)产物溶液中酶的残留较少，简化了提纯工艺；（5）酶的使用率提高，降低成本[14]。

5 发展前景
随着对纤维素酶的研究的深入，纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源等各个领域中发挥越来越大的作用。

加大对纤维素酶的研究和开发力度，改变目前规模较小、工艺设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下的现状，发展具有中国自主知识产权的新酶种、新产品，满足市场需求是当前纤维素酶研究工作者们的一项艰巨的任务。

参考文献
[1] 高论江，董全，唐春红.纤维素酶的研究进展及前景展望.江苏食品与发酵，2007，4.
[2] 顾方媛，陈朝银，石家骥，钱世钧.纤维素酶的研究进展及发展趋势.微生物学，2008，28（1）.
[3] 刘小杰，何国庆，陈启和.康宁木霉刀5纤维素发酵培养基的优化.浙江大学学报(工学版)，2003，37(5)
[4] 刘小杰.康氏木霉纤维素酶的发酵及其对稻草降解利用的初探.浙江大学博士学位论文.
[5]Reese，E..T，SiuR.Gand Levinson，H.S.The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis.J.Mieorboil.，1950，59
[6] 陈燕勤, 毛培宏, 曾宪贤.细菌纤维素酶结构和功能的研究.化学与生物工程，2004，6
[7] 王祖农.纤维素酶研究工作进展.山东大学微生物，1985，6(1)
[8] 董志扬，祝令香，于巍等.纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究.核农学报，2001，15(1)
[9] 肖春玲，徐常新.微生物纤维素酶的应用研究.微生物学杂志，2002，22(2)
[10] KimJ.0.，Park S.R.，LimW.J.，et al.Cloning and characterization of thermostable endgolueanase(Cel8Y) from the hypert thermophilic Aquifex aeolicus VF5.Biochemical&BioPhysical Research Communications，2000，279(2):
[11] 胡利勇，钟卫鸿.纤维素酶基因克隆及其功能性氨基酸研究进展.生物技术，2003，13(2)
[12] 吴长青，何国庆，董爱茶.纤维素酶的液态深层发酵研究进展.食品与发酵工业，2001，27（8）
[13] 王景林.纤维素酶固定化的研究进展.生命科学.1997，9(3)
[14] 夏黎明，余世袁，程芝.固定化里氏木霉制畜纤维素酶的研究.南京林业大学学报1993，17(2).。