实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013

实验十一产蛋白酶菌株的筛选

碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。

从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。

一、基本原理

⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。

⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。

⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋

白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。

二、实验目的

⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法

⏹学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术

⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法

三、实验器材

1．菌株

从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株

2．溶液和试剂

蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等

3．仪器和用品

三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸

四、操作步骤

1. 培养基和试剂的配制

（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶

（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%，KH2PO4 0.03%，3 mol/l NaOH 调节pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。

（3）pH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。

（4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。

2. 酶活标准曲线的制作

用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5 mL 0.4mol/l Na2CO3、1 mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30 min，680 nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。

3. 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株（周一下午）

取10g土样混于90mL无菌水中，梯度稀释后涂布到牛奶平板上（稀释梯度：10-3,10-4,10-5，两个平行，每组2块平板），37 ℃培养30h左右观察

建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株

4. 产蛋白酶菌株的观察、划线分离与转接（周三、周四）

对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，量取水解圈与菌落直径，计算其比例，选择比例最大的2株菌。转接到肉汤琼脂平板上进行划线分离（每组2块平板，周三），37 ℃培养过夜。

挑取单菌落斜面培养（周四下午，每组2支斜面），同时对单菌落进行革兰氏染色和形态观察（显微镜室，载破片）。（周三下午）

5. 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋白酶活力

将斜面上培养24 h的初筛菌株接种到发酵培养基中（每人1瓶），37 ℃、200r/min 摇床培养48h。（下周一）

6. 酶活力的测定（下周三）

离心获得粗酶液（8000 r/m，10min）

碱性蛋白酶活力单位U，以每毫升样品在40 ℃，pH 11条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸质量（）来表示。

U = K×A×N×5/10

K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪氨酸质量，本实验K = 200

N：稀释倍数

A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差

5/10：测定中吸取的滤液是全部上清液的1/5，而酶反应时间为10 min

五、实验报告

1. 结果记录

2. 思考题

（１）在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌的比例如何？试结合采样地点进行分析。

（２）在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？试结合你初筛和复筛的结果分析。