微生物育种学课程论文

微生物诱变技术研究进展

戴泽翰 08植物保护微生物1班 200830200508

摘要：人工诱变微生物育种具有速度快、收效大的优点，在生产和科研中被广泛应用。常规的微生物育种技术主要分为物理诱变、化学诱变、生物诱变三种。今年来三种诱变育种技术得到了长足的发展。本文就三者今年来的研究进展，尤其是新技术的发展进行综述。

关键词：微生物；诱变育种；进展

人工诱变手段诱发微生物基因突变,改变遗传结构和功能,通过筛选,从多种多样的变异菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株，是生产和科研中微生物研究中常用的育种方法。使用诱变育种，可以使菌株研发周期大大缩短，特别是在发酵工程育种上得到广泛的应用。近年来,随着新诱变因子的不断发现和筛选技术的发展,微生物诱变育种技术有了长足进步。

1物理诱变技术

物理诱变通常使用物理辐射中的各种射线,包括紫外线、X射线、γ射线、α射线、β射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙射线等。近年来，离子辐照、微波、超高压诱变育种也成为诱变育种的新方法。

1.1离子辐照诱变

离子束具有高传能线性密度(Let),且在射程的末端还有尖锐的电离峰(Bragg峰)。这使重离子能在生物介质中产生高密度的电离和激发事件,同时产生的高活度自由基造成间接损伤,从而引起较强的生理生化作用,可引起染色体的重复、易位、倒位、缺失或使DNA分子取代、补充、断裂等。有学者（张宁等，2008）通过10k eV氮离子(N+)注入β-胡萝卜素生产菌三孢布拉霉(Blakeslea trispora)筛选得到2株产量比出发菌株提高20%的高产菌株,经过多次传代试验表明该菌遗传稳定性较好,并对pH值、温度、转速等发酵条件进行初步优化,使β-胡萝卜素的产量达到2.2 g/L。另有学者(赵南等，2010)向井冈霉素产生菌注入能量10keV、剂量15×下1013个/cm2氮离子实施诱变,再生培养后单菌落接斜面上摇床进行效价测定,筛选高产菌株。结果获得诱变菌株9275#,其有效A组分含量较出发菌株提高33.52%,且具有高的遗传稳定性。

1.2微波

微波作为1种高频电磁波,它与生物组织的相互作用主要表现为热效应和非热效应。能刺激水、蛋白质、核酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动,这种震动能引起摩擦,能够对氢键、疏水键和范德华力产生作用,因此可以使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦,孢内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损,使得DNA结构发生变化,从而发生遗传变异。有学者(徐伟等,2010)采用带水循环冷却装置的微波设备,对紫红曲(Monascus purpureus)进行诱变处理,研究微波辐照功率和辐照时间对红曲霉菌的致死规律和突变规律,获得微波功率和时间的最佳辐照剂量,结果表明:在微波功率500W、辐照时间80s时,得到突变株W5S8,液态发酵产橙色素色价为16.38U/mL,较原始菌株橙色素色价10.26U/mL 提高了59.62%,连续遗传5代,产色素性状稳定。在低产双乙酰值酵母的筛选研究中（申文波等，2010），采用微波诱变与甲基磺酸乙酯(EMS)诱变相结合的方法对出发菌株 2.003进行诱变,以筛选出产双乙酰值低的酵母菌株。小试实验表明:与出发菌株相比,突变株B82的双乙酰生成量下降了40%;经大生产试验,突变株B82双乙酰峰值低、还原快,有一定的应用价值。

1.3超高压

高压导致细胞体积减小,胞内物质浓缩,使得先前互不接触的各种酶、蛋白质及核酸类物质接触,这种接触必然会导致一些不可预测的反应发生,如DNA在高压下会与切割DNA的核酸内切酶接触而使得DNA发生变化。研究发现, DNA在高压长时间处理下, DNA合成对压力敏感。高压可以影响到DNA 的超螺旋结构,甚至影响DNA母链的解旋,还使得DNA失去紧急修复的应急反应(SOS)机制。有研究人员（王岁楼等，2007）利用超高压技术对红酵母Rhodotorula glutinis NR06进行诱变处理,在300MPa 处理10min时获得一突变株NR06-H39,其β-胡萝卜素产量达到9.64mg/L,比出发菌株NR06的6.30mg/L提高了53.02%,且遗传稳定性良好。另有研究 (杜双奎等,2011) 报道，在对初选的细菌纤维素菌株J2进行超高压诱变,试验结果表明,超高压诱变压力、时间对细菌纤维素菌株有显著或极显著影响。细菌纤维素菌株高压诱变条件为压力250 MPa、时间15 min、温度25℃。经超高压诱变,获得产纤维素能力高、遗传稳定性好的诱变菌株M438。

2化学诱变育种技术

化学诱变的作用机制与物理诱变剂有很大区别,化学诱变剂都是与DNA起化学作用。化学诱变剂往往具有专一性,它们对基因的某部位发生作用,对其余部位则无影响。在一定程度上，诱变剂具有定

向突变的应用意义。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、移码突变剂。

2.1碱基类似物

这类物质与碱基有着相似的结构，通过取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变。由于作用位点单一，专一性强，碱基类似物常与其他诱变剂组合使用。但今年来出现了利用碱基类似物的单一诱变报道。在对产色素菌T_(17-2-39)的诱变育种试验中(程世清,2000)采用5-溴尿嘧啶（5－BU）作为诱变刘，对产色素菌（分枝杆菌T_17-2-39）细胞和原生质体进行诱变，分别获得比原菌株生物量和产色素量提高的新菌株，其中生物量分别平均提高22．5％和16．4％。在对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行的体外诱变中（张建云等，2010）采用基因体外定向进化策略中易错PCR技术,用碱基类似物5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP),对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选,得到5个具有高酶活的诱变基因,通过出发基因序列进行比较,分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变而引起的,而不是由启动子的变化引起的。

2.2 烷化剂

烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。在以林肯链霉菌9502(Streptomyces lincolnensis9502)为出发菌株,进行NTG诱变处理,并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选的研究里,得到产林肯霉素相对效价提高35.4%的变异株9502-7。对9502-7菌株孢子采用紫外线处理,得到变异高产菌株9502-7-12,其相对效价较出发菌株提高50%以上（丁琳，2010）。在诱变选育丁二酮高产菌株的研究中，以乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种为出发菌株,采用亚硝基胍进行诱变选育,得到高产丁二酮菌株,用邻苯二胺比色法检测突变株丁二酮,其产量达到0.72mg/L,比出发菌株产量0.056mg/L提高12.9倍,且遗传性质稳定（于鹏等，2006）。

2.3 移码突变剂

吖啶及其衍生物类可插入到DNA分子中，通过复制过程导致遗传密码中碱基移位重组，最终改变突变株的遗传特性.在对枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性改良的研究中（顾真荣，2008），用诱变剂吖啶橙诱变得到20个突变株,其中5个突变株Ga1、Ga8、Ga12、Ga1和Ga19在肉汤和PDA平板上形成粘液状菌落,完全不同于出发菌株。PDA平板抑菌圈试验,突变株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌产生比野生株G3更大的透明抑菌圈。其中Ga1菌株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌的抑菌带宽分别是G3的1.71和