蛇龙珠自然发酵过程酵母菌的种类和动态变化

蛇龙珠自然发酵过程酵母菌的种类和动态变化
宋育阳，裴颖芳，刘延琳*
（西北农林科技大学葡萄酒学院, 陕西杨凌 712100）
摘要:利用WL营养琼脂培养基，对蛇龙珠Carbernet Gernischet葡萄酒自然发酵不同阶段分离的94株酵母菌进行鉴定。

结果表明，供试酵母菌属于4个属5个种：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum、季也蒙有孢汉逊酵母Hanseniaspora guilliermondii、克鲁维毕赤酵母Pichia kluyver和假丝酵母Candida zemplinin，分别占分离总菌株的68%、1.06%、6.38%、19.15%、5.41%。

关键词：葡萄酒；酵母鉴定；自然发酵
Species of Yeasts and the Dynamic Changes during Spontaneous Fermentation Related to Carbernet Gernischet
Song Yuyang, Pei Yingfang, Liu Yanlin*
（College of Enology, Northwest A & F University, Yangling, Shannxi, 712100 China）
Abstract 94 yeasts isolated from spontaneous fermentation of Carbernet Gernischet were identified primarily on Wallerstein Laboratory Nutrient Agar (WL agar).Five species of four genera belonging mainly to Saccharomyces cerevisiae、Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora guilliermondii、Pichia kluyver and Candida zemplinin were found among all stains, with proportion of 68%、1.06%、6.38%、19.15%、5.41% respectively.
Keywords: wine; yeast identification; spontaneous fermentation
葡萄酒发酵过程是一个复杂的生态和生化过程，包含不同酵母属种此消彼长的变化。

多种酵母在发酵过程中的相互协作，可以有效地增加葡萄酒风味的多样性[1]，但也可能影响葡萄酒质量的稳定性[2]。

研究发酵过程中酵母菌的动态变化，揭示在发酵不同阶段酵母菌的消长规律，有利于葡萄酒发酵过程中的微生物学控制，也可以为研究酵母菌对葡萄酒风味的影响提供依据[3]。

一种快速准确的身份识别手段正成为酵母使用者和生产者必须考虑的因素[4.5]。

要达到快速简便的监测发酵过程中的微生物变化，Wallerstein实验室设计了一种观测酿造和工业发酵过程中微生物种群的非选择型培养基—WL营养培养基（Wallerstein laboratory nutrient agar）[6]，可用来区分和鉴定一些常见的葡萄酒相关酵母。

研究表明葡萄酒自然发酵过程中出现的大多数典型的酵母菌都可以基于其在WL培养基上生长所形成的菌落颜色及形态进行归类和区别[6-8]，并通过分子方法验证了其结果的准确性。

本研究利用WL营养琼脂对宁夏蛇龙珠葡萄自然发酵不同阶段分离的酵母进行分类，观察了发酵过程中菌群种类和变化，旨在揭示宁夏葡萄自然发酵过程中酵母菌的消长规律。

为发酵工业的微生物控制及后续研究提供依据。

1 材料和方法
[基金项目]国家葡萄产业技术体系建设专项经费资助
[作者简介]宋育阳(1983-)，女，浙江余姚市人，硕士研究生，主要从事酿酒微生物研究。

E-mail: songyuyang1208@ *[通讯作者]刘延琳，E-mail:lylsun@
1.1 材料：
1.1.1 菌株：宁夏蛇龙珠葡萄品种自然发酵过程中分离的酵母菌株。

1.1.2 分离用培养基 YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH值自然，121℃灭菌20min，添加100mg/ L的氯霉素以排除细菌的干扰。

固体培养基可加入2%琼脂。

酵母菌株的初步形态分类用WL营养培养基[6]调pH至6.5，121℃灭菌20min。

1.2 方法
1.2.1 菌株分离将成熟果粒破碎、带皮进行自然发酵。

分别在葡萄酒发酵的初期、中期、后期3个时期取样。

采来的样用稀释梯度涂布法接种于固体YPD培养基上，在28℃下培养3d，然后根据菌落颜色及形态，每平板选择15～20个单菌落在YPD 液体培养基中培养1d，活化的菌液与30%的无菌甘油以1：1混合于1.5mL离心管中，-70℃下保藏。

1.2.2 菌株的WL培养基聚类分析将保藏的酵母菌株用液体YPD培养基活化后，划线接种于WL培养基上，28℃培养5～7d 后，观察记录菌落的颜色和形态，并根据菌落的颜色和形态进行聚类。

2 结果与分析
2.1 葡萄酒自然发酵中酵母菌的种类
表1 蛇龙珠自然发酵分离菌株WL形态描述鉴定
Tab.1 Descriptions of yeast colonies on WL medium separating from Carbernet Gernischet
菌株Strain
菌落颜色
Colony color
WL形态描述
Colony on WL
培养类型
Type
Ss1-15 深绿色
Intense green 扁平，表面光滑，不透明，黄油状
Flat, smooth,opaque,consistency of
butter
葡萄汁有孢汉逊酵母
Hanseniaspora
uvarum
S1-2,S1-4,S1-6~S1-10,S1-13,S1-15,S2-2 S2-4,S2-5,S2-7,S2-8,S3-3,Ss3-7,Ss3-13, Ss3-22
白色带淡绿色
White with pale green
表面褶皱，粗糙，扁平
Wrinkle surface ,roughness ,flat
毕赤克鲁维
Pichia kluyveri
Ss1-7,S2-11,Ss3-15,Ss3-20,SS3-21 中央深绿色泛白
Green with white in
center 四周浅黄色透明，扁平，表面光滑
transparent yellow around, flat,
smooth
季也蒙有孢汉逊酵母
Hanseniaspora
guilliermondii
S1-1,S1-3,S1-5,S1-11~S1-13,S2-1~S2-4 S2-6,S2-9,S2-10,S2-12,S3-1~S3-9,S3-11 Ss1-1~Ss1-6,Ss1-8,Ss1-10~Ss1-14,Ss1-1 6,Ss1-18,Ss2-1~Ss2-4,Ss2-6~Ss2-8,Ss2-10,Ss2-13,Ss2-14,Ss3-2,Ss3-3,Ss3-5,Ss3 -6,Ss3-8~Ss3-14,Ss3-16~Ss3-19奶油色带绿色
Cream to green
球形突起，表面光滑，不透明，奶
油状
Knobike,surface,smooth,opaque,
consistency of cream
酿酒酵母
Saccharomyces
cerevisiae
S3-10，Ss2-5，Ss2-9，Ss2-11，Ss2-15 中央奶油色边缘绿色
Cream and green frink
扁平，光滑，不透明
Flat surface: smooth, opaque
假丝酵母
Candida zemplinina
注：Ss、自然发酵时添加SO2（40mg/L）；S、自然发酵未添加SO2; 1、2、3为发酵的初期、中期、后期
Note：Ss、fermentation, add SO2(40mg/L); S、fermentation, not add SO2；1，2，3：the early stage，middle stage，end stage of the spontaneous fermentation 本研究在蛇龙珠发酵的初、中、后期总共分离得到94株葡萄酒相关酵母菌。

利用WL培养基对自然发酵过程中分离的酵母菌的培养形态进行观察，参照Christina实验结果[6]及杨莹等[7]对WL培养基类型的描述以及分子生物学验证鉴定结果，将分离获得的菌株分为五种不同的培养类型（表1），分别是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、葡萄汁有孢汉逊酵母
Hanseniaspora uvarum、季也蒙有孢汉逊酵母Hanseniaspora guilliermondii、克鲁维毕赤酵母Pichia kluyver和假丝酵母Candida zemplinin。

分别占到了分离总菌株的68%、1.06%、6.38%、19.15%、5.41%。

2.2 自然发酵过程中酵母菌群的变化
自然发酵过程中，酵母种类会随发酵时间有规律地消长。

本试验在自然发酵各时期出现的酵母菌中，发酵初期分离得到了S.cerevisiae、H. uvarum、H.guilliermondii和P.kluyver；自然发酵中期和后期出现的类型有S.cerevisiae、H.guilliermondii、P.kluyver和C.zemplinin，其比例详见表2。

本研究在自然发酵初期监测到的菌种有H. uvarum、H. guilliermondii、S. cerevisiae、P. kluyver为发酵的启动菌种，其中S. cerevisiae和P. kluyver为启动发酵的主要菌种。

随着发酵过程中乙醇的产生，这些非酿酒酵母开始逐渐减少和死亡，3-4天后，到发酵中期监测到H. uvarum死亡，但H. guilliermondii数量增多，P. kluyver比初期的含量有所下降，同时S. cerevisiae由于其良好的酒精耐受力而在发酵液中占主导地位，中期还分离得到C.zemplinin。

到发酵后期S. cerevisiae成为主要发酵群体。

结合表2可以看出，在发酵前期，启动发酵的有一些非酵母属酵母，随着发酵的进行和酒度的升高，能分离到的主要是较耐酒精的酵母，但以酿酒酵母占绝对优势，这也与酿酒酵母是酒精生产和果汁发酵酿酒的主要菌种的结果相符[9]。

表2 发酵各阶段酵母菌种类、数量和比例
Table2 Species and proportion of yeast in different stage of must fermentation
种名Name of species 分离源：蛇龙珠自然发酵醪
From: spontaneous fermenting mash
分离源：添加40 mg/L SO2的蛇龙珠自然发酵醪
From: fermenting mash supplemented with40 mg/L SO2酵母数量:株数(比例/%)
Yeast strain number / ( Proportion%)
酵母数量:株数(比例/%)
Yeast strain number/ ( Proportion %)
发酵前期
Beginning stage
发酵中期
Middle stage
发酵末期
Final stage
发酵前期
Beginning stage
发酵中期
Middle stage
发酵末期
Final stage
S. cerevisiae6/(40) 8/(61.5) 10/(91) 14/(87.5) 11/(64.7) 15/(68.2) H. uvarum ———1/(6.25) ——
H.guilliermondii ———1/(6.25) 2/(11.8) 3/(13.6)
P. kluyver9/(60) 5/(38.5) 1/(9) ——3/(13.6)
C.zemplinina ————4/(23.5) 1/(4.6) 注：—未检出
Note：— no detected
2.3 SO2在自然发酵中对酵母种类的影响
从表2可以看出，在添加SO2的情况下，对SO2不太敏感的C.zemplinina在发酵中后期都分离得到。

在未添加SO2时，P. kluyver在发酵前期浓度较大，发酵活性较高，为启动发酵的主要菌种，添加SO2后，P. kluyver数量被抑制，但随着游离SO2降低，其数量有所上升。

而对SO2敏感的H. uvarum在发酵的中后期未分离到，H. guilliermondii在发酵中期游离SO2降低得比较多的时候数量有所上升。

进入发酵中期直至发酵末期，绝大部分酵母为酿酒酵母。

不过发酵末期从葡萄醪中还能分离到耐SO2和酒精的C.zemplinina。

本实验中，在加入40 mg/L SO2自然发酵初期分离到的S. cerevisiae占初期分离酵母的87.5%，而在未加SO2的自然发酵初期S. cerevisiae仅占到40%，发酵初期添加SO2的发酵醪中S. cerevisiae的数量是未添加SO2时的1倍以上。

无论是否添加SO2，发酵后期都是酿酒酵母S. cerevisiae占据主导地位。

3 讨论
WL营养琼脂培养基(wallerstein laboratory nutrient agar )最初被设计用来检测饮料中微生物菌群，随后，在葡萄酒相关酵母的鉴定中证实，其对葡萄汁自然发酵过程中出现的绝大多数菌种具有很好的鉴别力[12]，可以简化后续分子鉴定的程序，同时可以避免生理生化分析很大的工作量，作为酵母菌鉴定的辅助手段。

WL营养琼脂是相当简便、快速并且十分有效和节俭的方法。

根据酵母菌落在WL营养琼脂培养基上颜色和形态的不同可以把大多数酵母菌区分开来。

本研究结果为筛选适合该产区葡萄酒生产的优良酿酒酵母菌种奠定了基础，但有关该产区野生酵母的发酵特性及其利用价值还需做进一步研究。

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