青藤碱对脑缺血再灌注损伤大鼠环氧_省略_酶_2表达和血脑屏障通透性的影响_俸军林

方脑得生主要有效成分得到了较好的分离,展示了较完整的
HPLC 色谱图。

中药提取物复杂成分不经分离直接与模拟生物膜结合,符合中药多成分、多靶点协同作用的特点;由于模拟生物膜可以通过改变相关的影响因子很方便地模拟人体的生理环境,且具有较好的稳定性,从而为研究药物在体内的吸收以及活性成分的筛选和研究提供了一种简便的模型。

参考文献:
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收稿日期:2009-06-16; 修订日期:2009-11-16
基金项目:广西壮族自治区自然科学基金(No .0848015)作者简介:俸军林(1965-),男(瑶族),广西桂林人,现任桂林医学院附属医院神经内科副主任医师,硕士学位,主要从事脑血管、癫痫的基础与临床研究工作.
青藤碱对脑缺血再灌注损伤大鼠
环氧化酶-2表达和血脑屏障通透性的影响
俸军林,李 浩,蒋静子,吴 岚,刘开祥,唐永刚
(桂林医学院附属医院,广西桂林 541001)
摘要:目的探讨青藤碱(si no m en i ne ,S i n)对缺血再灌注损伤大鼠脑组织保护作用及对环氧化酶-2(cyclooxyg enase-2
,COX -2)表达和血脑屏障通透性的影响。

方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、S i n 低剂量治疗组和Si n 高剂量治疗组,线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。

S i n 低(S i n30mg /kg )、高剂量(60m g /kg)治疗组于术前30m i n 分别给予大鼠腹腔注射。

用免疫组化法观察缺血90m i n 再灌注24h 大鼠额顶部皮质COX -2表达及脑含水量和伊文斯蓝(EB )含量变化,并进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC )染色观察脑梗塞体积变化和神经症状评分。

结果Sin 高、低剂量治疗组神经功能缺失评分较缺血再灌注组降低,高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P <0.05)。

S i n 高、低剂量治疗组脑梗塞体积较缺血再灌注组减小,高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P <0.05)。

与假手术组比较,缺血再灌注组额顶部皮质COX -2表达明显增加;与缺血再灌注组比较,Sin 高、低剂量治疗组COX -2表达均显著减少(P <0.05),高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P <0.05)。

与假手术组比较,缺血再灌注组脑含水量和EB 含量明显升高;与缺血再灌注组比较,S i n 高、低剂量治疗组脑含水量和EB 含量明显降低(P <0.05),高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P <0.05)。

结论S i n 对缺血再灌注脑损伤具有保护作用,其机制可能是通过抑制再灌注损伤后COX -2表达,减轻血脑屏障通透性。

关键词:青藤碱; 缺血再灌注; 环氧化酶-2; 血脑屏障
中图分类号:R962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2010)04-0806-02
E ffect of Sino m eni n e on t he Expression of Cyclooxygenase -2and the P er m eability of t he B lood -brain Barrier Follo w ing Cerebral Ische m ic Reperfusion Injury in Rats
FENG J un -lin ,L I H
ao ,JIANG J i n -z,i W U L an ,L I U K a-i x iang ,TANG Y ong -gang (Depart m ent of N eurolo gy ,the Affili a ted H os p ital of Guilin M ed ical C ollege ,Guilin 541002,China )Abst ract :O b jective T o st udy the t he effect o f si no m eni ne on expression of cyc l ooxygenase-2and the per m eab ili ty o f t he b l ood
-bra i n barrier o f ce rebra l ischem ia reperfus i on(I /R )i n j ury in rats .M ethod s In this exper i m ent ,ra tsw ere rando m l y div i ded i nto 4groups :sha m operated group ,I /R g roup ,l ow si nom en i ne treated group and h i gh si nomenine treated g roup .The foca lm i ddle ce rebra l artery occlus i on(M CAO )mode lw as m ade by sut ure-occluded m ethod .S i no m eni ne w as g i ven i ntraper itonea lly t o rats 30m in before f oca l cerebral ischem ia ope ration respectively.A fter 90m in M CAO fo ll ow i ng 24h of reperfusi on ,the expressi on o f cyc l ooxygenase -2w it h i m m unoh i stochem istry w ere i nvestigated .B ra i n w ate r con tent and the con tent of Evens bl ue (EB)were i n -vesti ga ted.TTC sta i ni ng and t he neuro l og ical score w ere a lso i nvesti g ated .R esu lts Com pared w ith I R group ,the neuro l og ica l score w as decreased i n l ow and h i gh dose sinomen i ne treated g roups (a ll P <0.05).(2)Com pared w ith I/R group ,l ow and h i gh sinom en i ne trea ted g roups dose-dependentl y reduced cerebra l i nfarction (a ll P <0.05).(3)Co m pa red w ith s ham ope rated g roup ,expressi on o f cyc l ooxygenase-2w as i ncreased at 24h reperfusi on in t he frontal and parieta l cortex (P <0.05).Co m pared w it h I/R g roup ,low and hi gh si no m enine trea ted groups dose -dependently reduced expressi on of cyc l ooxyg enase-2(all P <0.05).(4)Compared w ith sha m ope rated group ,bra i n wa ter content and the content o f EB w ere i ncreased at 24h of reperf usion .Co m pa red w it h I /R groups ,l ow and h i gh s i nom en i ne treated group dose-dependen tly reduced bra i n w ate r content and t he content o f EB (P <0.05).Conc l u sion S i no m enine m ay obv i ous l y reduce cerebral ische m i a -reperf usion i njury by decreasi ng t he ex -#
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pression o f cy clooxygenase-2and the permeability o f b l ood-bra i n ba rrier.It has protecti v e effect on cerebra l ische m i a i n j ury.
K ey w ords:Si nomen i ne;Ische m i a-repe rf usion;Cyc l ooxygenase-2;B lood-brai n barrier
研究表明,炎症反应是脑缺血再灌注损伤的重要病理生理机
制,花生四烯酸环氧化酶途径在缺血后神经元损伤的炎症机制中
具有重要作用。

诱导型环氧化酶-2(C OX-2)是催化花生四烯
酸合成前列腺素E
2(P rostag l and i n E
2
,PG E
2
)的关键酶,而PG E
2
是炎症反应中最主要的炎症介质之一。

青藤碱(si no m eni ne, S i n)是从中药青风藤S i no m eniu m acutu m中提取的生物碱单体,具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用[1,2]。

体外实验表明[3],S i n对COX-2活性有选择性抑制作用。

本研究旨在观察S i n对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠COX-2活性和血脑屏障通透性的影响,从而探讨S i n脑缺血再灌注损伤的影响及机制。

1仪器与材料
751分光光度计(上海仪表九厂),青藤碱粉(湖南正清医药公司),TTC试剂(上海医药总公司),COX-2一抗(武汉博士德生物工程公司)。

健康W istar大鼠,雄性,清洁级,共80只,质量(250?30)g(广西医科大学动物实验中心提供)。

2方法
2.1给药方法将实验动物按随机分组原则分成假手术组(20只)、缺血再灌注组(20只)、Sin低剂量治疗组(20只)及S i n高剂量治疗组(20只)。

S i n低剂量治疗组(30mg/kg)和高剂量治疗组(60m g/kg)均于术前30m i n分别给予大鼠腹腔注射,假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射。

缺血再灌注组和S i n低、高剂量治疗组建立脑缺血90m i n再灌注24h动物模型。

2.2动物模型的建立参照L onga等[4]的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。

采用颈外动脉插入线栓法,各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。

线栓采用石蜡线栓。

线栓直径约0.27mm,插入深度约18mm,此时线栓头位于大脑中动脉起始部。

缺血90 m i n时,抽提线栓实现再灌注。

神经功能缺陷评分:按照Long a 等[4]的评分标准,各组分别在再灌注24h进行评分。

0分:正常,无神经学征象;1分:动物不能完全伸展右前肢;2分:动物右侧肢体瘫痪,行走时向右侧转圈,出现追尾现象;3分:动物行走向右侧跌倒,或动物不能站立或动物打滚;4分:无自发活动,有意识障碍。

神经功能缺陷评分在1~3分为模型成功。

0分和4分为模型不成功予以剔除,在后续实验中补充剔除出组的动物,以保证每组动物数不变。

2.3COX-2免疫组化染色再灌注24h,各组随机取5只大鼠,用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定,断头取脑。

在左侧大脑半球距离嗅球尖端7~11mm之间冠状切取约5mm厚脑组织块,固定、脱水、包埋成蜡块,连续切片,厚5L m。

连取5张,1张作HE染色,其余4张作免疫组化染色。

用SP法进行COX-2的免疫组化染色。

阴性对照片用PBS液代替一抗。

于每个鼠脑取1张切片,每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野(400@),计数每个视野阳性细胞数,算出平均数即为每张切片阳性细胞数。

2.4脑含水量检测再灌注24h,各组随机取5只大鼠,断头取脑后快速称取左右大脑半球湿重,置110~115e烤箱内烤至恒重,再分别称其干重,用(湿重-干重)/湿重的百分比作为衡量脑含水量指标。

2.5血脑屏障通透性检测参照M atsuo等[5]的方法,采用EB染料检测BBB通透性。

再灌注24h,各组随机取5只大鼠,经股静脉注射2%EB生理盐水3m l/kg。

2h后,大鼠麻醉,由左心室用生理盐水灌流至右心耳流出清亮液体,然后断头取脑,称湿质量后置入装有0.5m l1m ol/L KOH溶液的离心管中,37e过夜,然后加入丙酮。

离心15m i n,重复3次取上清液,用751型分光光度计在波长620n m处测定吸光度值。

根据EB液的标准曲线,计算脑组织中的EB水平。

2.6TTC染色再灌注24h,将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。

将鼠脑置于-4e冰箱20m in后,将其切成5等份冠状位切片,置于2%TT C溶液中,水浴、多聚甲醛液固定。

用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗塞灶体积,各脑片梗塞灶体积之和即为梗塞体积。

2.7统计学方法数据处理采用SP SS1
3.0统计软件进行运算,结果以
x?s表示,组间差异显著性检验采用方差分析。

3结果
3.1各组神经功能评分的比较见表1。

假手术组无神经功能缺损。

与假手术组比较,缺血再灌注组神经功能评分明显增加(P<0.05),S i n高、低剂量治疗组大鼠的神经功能评分低于缺血再灌注组(P<0.05),高、低剂量组之间差异有显著性(P<0.05)。

3.2各组脑梗塞体积的比较见表2。

TCC染色后,缺血再灌注24h左侧大脑半球梗塞灶区呈白色,主要为额顶部皮质和尾壳核,正常组织呈红色(图1)。

S i n高、低剂量治疗组梗塞体积较缺血再灌注组显著减小(P<0.05)。

S i n高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。

表1各组神经功能评分的比较(
x?s)分
组别神经功能评分
假手术0
缺血再灌注2.60?0.55v
S i n低剂量治疗1.20?0.45*
S i n高剂量治疗1.40?0.55*w 与假手术组比较,v P<0.05;与缺血再灌注组比较,*P<0.05;与S i n低剂量治疗组比较,w P<0.05;n=5
3.3脑含水量和EB含量的比较见表2。

缺血再灌注组脑含水量和EB含量明显升高,与假手术组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);与缺血再灌注组比较,S i n高、低剂量治疗组脑含水量和EB含量明显降低(P<0.05),高、低剂量组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)。

表2各组脑梗塞体积、脑含水量和EB含量的比较(
x?s)组别脑梗塞体积V/mm3脑含水量(%)EB含量C/L g#g-1假手术078.71?1.1878.71?1.18缺血再灌注188.0?10.71v96.92?2.27v96.92?2.27v S i n低剂量治疗136.9?8.37*89.24?1.25*89.24?1.25* S i n高剂量治疗112.82?9.03*w83.79?1.97*w83.79?1.97*w 与假手术组比较,v P<0.05;与缺血再灌注组比较,*P<0.05;与S i n低剂量治疗组比较,w P<0.05;n=5
3.4各组COX-2表达的比较见表3。

假手术组脑组织中未见COX-2阳性表达。

缺血再灌注组和S i n高、低剂量治疗组COX -2免疫阳性细胞主要存在于额顶部皮质,纹状体区亦有少量表达(图2)。

S i n高、低剂量治疗组额顶部皮质C OX-2表达较缺血再灌注组减少(均P<0.05);高、低剂量组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3各组COX-2表达的比较(
x?s)
组别COX-2(个/400倍)
假手术0
缺血再灌注77.6?7.8v
S i n低剂量治疗65.8?7.1*
S i n高剂量治疗52.2?5.1*w 与假手术组比较,v P<0.05;与缺血再灌注组比较,*P<0.05;与S i n低剂量治疗组比较,w P<0.05;n=5
4讨论
S i n是从防己科植物青风藤中提取的生物碱单体,在治疗类
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风湿性关节炎及心律失常中发挥了较好疗效。

梁健等[6]给予缺
血再灌注大鼠青藤碱治疗,显示青藤碱对缺血再灌注脑损伤有保护作用,但具体机制尚不清楚。

本实验结果也表明,脑缺血再灌注损伤大鼠给予不同剂量的Sin 治疗,可明显改善神经功能评分,减少梗塞体积,对缺血脑组织有保护作用,并且高剂量S i n 的
脑保护效果更显著。

图1 大鼠脑缺血再灌注24h TTC 染色 图2 缺血再灌注组COX-2阳性细胞表达(SP 染色,400@)
COX 又称前列腺素合成酶(prostag landin synthase ,PG S),是
花生四烯酸代谢转化为前列腺素(prostag landi n ,PG )的催化酶。

COX 以二种形式存在于组织中,其中诱导型COX -2在大多数正常组织内检测不到,但在脂多糖、IL -1等多种病理生理刺激下均可诱导表达,催化花生四烯酸生成的主要代谢产物为PGE 2、PG I2和血栓素TXA2,三者至少可在脉管系统、血脑屏障和神经元本身3个环节加重缺血性脑损伤。

COX -2代谢产物介导脑
损伤的可能机制为:¹血栓素TAX 2和前列腺素具有趋化血小板
和中性粒细胞粘附于血管内皮细胞作用,并促进血脑屏障开放;º增加氧自由基的生成和NO 毒性效应;»加重缺血后神经细胞
的凋亡,等等。

姚小梅等[7]研究发现在大鼠脑缺血再灌注后
COX -2阳性神经元分布多位于梗死边缘形态貌似正常的神经
元和缺血边缘损伤的神经元,COX -2阳性神经元多位于梗死边缘,提示COX -2表达对缺血性半暗带神经元的生存和死亡中起重要作用。

前期研究已证实[8],给予缺血再灌注大鼠COX -2抑制剂对缺血脑组织具有脑保护作用。

本实验结果显示,缺血再灌组大鼠脑组织COX -2表达明显增加,脑组织内EB 含量和脑含
水量亦明显高于假手术组,表明缺血再灌损伤后COX -2表达增多,催化花生四烯酸代谢生成PGE 2等代谢产物,促进血脑屏障开放导致脑损伤。

近年来发现,Sin 具有抑制I L -1B 、IL-8的作用[9]。

体外细胞培养研究发现[3],Sin 对COX -2活性具有一定的选择性抑制作用。

本研究通过给予S i n 治疗脑缺血再灌注损伤大鼠,显示S i n 可减少再灌注损伤后C OX -2表达,减少脑组织内EB 含量和脑含水量,表明再灌注损伤后,S i n 可通过抑制COX -2表达,减轻缺血对血脑屏障破坏,维持血脑屏障的完整性,降低脑细胞的水肿程度,发挥脑保护作用,而且高剂量S i n 的脑保护效果更显著。

S i n 对脑缺血再灌注损伤的影响及机制是复杂的,它对脑缺血再灌注损伤后其他炎症细胞因子的影响尚有待进一步研究。

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18(4):241.收稿日期:2009-09-21; 修订日期:2009-12-23
基金项目:国家重点基础研究发展计划(No .2007CB512603)。

作者简介:张 伟(1982-),男(汉族),河南商丘人,现为浙江中医药大学在读硕士研究生,学士学位,主要从事中药药理研究工作.
*
通讯作者简介:吕圭源(1954-),男(汉族),浙江新昌人,现任浙江中医药大学教授,博士研究生导师,主要从事中药药理研究工作.
菟丝子功效性味归经与现代药理学的相关性研究
张 伟1
,陈素红2
,吕圭源
1*
(1.浙江中医药大学,浙江杭州 310053; 2.温州医学院,浙江温州 325035)
摘要:目的运用现代药理学来阐述菟丝子传统的功效及药性理论,分析总结二者的相关性。

方法通过机检中国期刊全
文数据库(1991~2008)和手检中医药文献,对近年来有关菟丝子的文献进行分析,把有关菟丝子的现代药理学研究和其
性味归经的相关性进行汇总。

结果菟丝子性味归经与其药理作用具有一定的相关性:菟丝子味甘性温,入肝肾脾经,滋补肝肾,又可补脾,与/滋补肝肾0功效相关的药理作用有性激素样作用、延缓衰老、抗脑缺血、抗骨质疏松、降血糖和血脂、提高免疫、抗肝损伤;与/明目缩尿0功效相关的药理作用有抑制白内障生成、抗遗尿。

结论菟丝子的药理作用与其性味、归经有吻合之处,为菟丝子的进一步研究开发及临床应用提供依据。

关键词:菟丝子; 功效; 性味归经
中图分类号:R2-03 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2010)04-0808-04
Research on t he Relationship bet ween the E ffect ,F lavor andM eridian Tropis m of Cuscu -#
808#时珍国医国药2010年第21卷第4期L IS H I ZHEN M ED I C I NE AND M ATER I A M EDICA RE SEARCH 2010VOL .21NO.4。