SD大鼠1型糖尿病动物模型的建立

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・实验研究・
ＳＤ大鼠１型糖尿病动物模型的建立
唐山钢铁集团有限责任公司医院（０６３０２０）常利民
上海交通大学医学院附属第九人民医院蓑蓑言妻姜主妻萎【摘要】目的探讨制作理想糖尿病动物模型的方法。

方法采用空腹腹腔一次性注射６５ｍｇ／ｋｇ链脲佐菌素的方法，建立ｓＤ大鼠１型糖尿病模型。

结果造模１周后测血糖均高于１６．７ｍｎ帕Ｉ／Ｌ。

持续观察８周，血糖值始终在建模初期高血糖水平上波动，未见到复转，并出现典型的“三多一少”症状，胰腺符合糖尿病成模动物胰腺病理变化。

结论采用空腹腹腔一次性注射６５ｍｇ／ｋｇ链脲佐菌素的方法复制出１型糖尿病模型，具有造模方法简便、用药量小、药物毒性较低、胰岛Ｂ细胞损害特异性高等优点，可应用于糖尿病及其并发症研究的各个领域。

【关键词】糖尿病，１型；模型，动物；链脲佐菌素
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随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率呈上升趋势，糖尿病的相关研究越来越受到人们的重视，而建立相应的动物模型是研究糖尿病的重要手段之一。

目前建立糖尿病动物模型的方法较多，如实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病动物模型和转基因糖尿病动物模型等。

由于实验条件的限制，实验性糖尿病动物模型是目前常用的方法。

本研究旨在探讨采用链脲佐菌素诱导构建糖尿病动物模型的最佳方法。

１材料与方法
１．１主要试剂和仪器设备
１．１．１主要试剂：链脲佐菌素（ＳＴＺ）：美国Ｓｉｇｍａ公司提供；柠檬酸（Ｃ６Ｉ－Ｉｓ０７・Ｈ２０）：中国松凯实业有限公司提供；柠檬酸三钠（Ｃ６ＨｓＯＴＮａ３・２Ｉ－１２０）：上海试四赫维化工有限公司提供。

１．１．２主要溶液的配制：０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．０柠檬酸缓冲液的配制：第一步：配制Ａ液（０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸水溶液）：
通信作者：董佳生柠檬酸２１．０１ｇ加入蒸馏水至１０００ｍＬ。

第二步：配制Ｂ液（０．１ｎ［ｎｌ／Ｌ柠檬酸钠水溶液）：柠檬酸钠２９．４ｌｇ加蒸至１０００ｎ１Ｌ。

第三步：Ａ液３３．ＯｍＬ＋Ｂ液１７．ＯｍＬ再加蒸馏水至１０００ｌＴｌＬ，即可配制形成０．１ｍｄ／Ｌ，ｐｎ４．０柠檬酸盐缓冲液。

ＳＴＺ溶液配制：以０．１ｍｄ，ｐｎ４．０柠檬酸缓冲液溶解，配制成４ｒａｇ／ｍＬ的溶液，Ｏ．２２／ａｎ滤器除菌，现用现配，配好的溶液置冰盒中保存，运输。

１．１．３仪器设备：Ｏｎｅ－－Ｔｏｕｃｈ血糖仪：美国强生公司；乐康全血糖试纸：罗氏诊断公司；Ｏ．２２胛针孔滤器：Ｃｏｎａｎｇ，德国。

１．２实验动物及分组
无特定病原体（ＳＰＦ）级８周龄雄性（∞）大鼠，数量４０只，体质量１９０～２２０ｇ，复旦大学医学院动物实验中心提供。

随机分为２组：对照组２０只，实验组２０只。

所有大鼠均以标准颗粒饲料、标准笼喂养，每笼５只。

各组大鼠实验期间均自由进食、饮水。

自然昼夜照明，室内通风良好，氨浓度＜２０ｐｐｍ。

相对湿度为４０％～７０％，室温保持在１８－－２２℃。

１．３造模方法
ＳＤ大鼠经适应性饲养２周后行诱导。

诱导前禁食１２
ｈ，按体质量给予６５ｍｇ／ｋｇ跚亿（以Ｏ．１ｔｏｏｌ／Ｌ、ｐｎ４．０无菌柠檬酸借檬酸钠缓冲液临用时配制成４ｍｇ／ｍＬ浓度）腹腔一次性注射。

对照组给予等量的无菌柠檬酸／柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。

对症状较重的糖尿病大鼠腹腔注射鱼精蛋白锌胰岛素１～４Ｕ／ｄ，以降低死亡率。

１．４糖尿病大鼠各项指标检测
注射前及注射后１、２、４、６、８周分别对两组动物血糖浓度进行测定，若诱导前血糖水平＜８．９ｍｎｄ／Ｌ，注射１周后动物血糖浓度＞１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ即判定为１型糖尿病动物模型，其中尾静脉采血测外周血糖，应用罗氏诊断公司乐康全血糖试纸测定血糖，同时每周测体质量。

１．５标本采集和制作
糖尿病大鼠模型成功诱导后８周与对照组同时处死，分离胰腺，置于１０％中性福尔马林溶液中用于制备石腊组织块，其余部分置于一７０℃保存备用。

石腊组织块定向切
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色，观察胰岛病理变化。

１．６统计学处理
所有实验数据用ＳＡＳ６．１２统计软件处理，结果以至±５表示，进行方差分析及ｔ检验，以Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。

２结果
２．１大体观察：实验组诱导后１周血糖逐步升高，均在１６．７ｎｍ∞Ｌ／Ｌ以上。

随着病程的进展，血糖稳定地保持在较高水平，糖尿病大鼠逐渐出现毛色灰暗、枯黄，杂乱，易激惹，体质量明显减轻，皮肤变薄，糖尿病“三多一少”症状明显。

诱导８周后糖尿病鼠陆续出现白内障。

２．２血糖、体质量变化：见表ｌ。

由表１可见，诱导后１周实验组大鼠血糖明显升高且持续高水平，而对照组血糖始终正常，二者比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。

对照组体质量正常增长，实验组大鼠体质量增长缓慢，与对照组比较
片厚度５ｐｍ，贴片，干燥，保存。

常规苏木素一伊红（ＨＥ）染差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）。

衰１两组各阶段空腹血糖体质量比较（ｊ±ｓ）
２．３大鼠糖尿病模型胰腺的形态观察：对照组大鼠胰岛为圆形或椭圆形的细胞团，分散于胰腺腺泡之间，数量较多，无包膜，细胞团块大小不一，Ｂ细胞数量较多，胞质丰富，核圆形；实验组胰岛萎缩，数量减少，分布稀疏，胰岛细胞发生退行性改变，数目减少，胰岛中Ｂ细胞数量减少、肿胀，胞质着色浅，细胞核固缩，胰岛间质纤维化。

３讨论
糖尿病是一种发病率较高的代谢性疾病，具有广泛而严重的并发症及很高的致残率和致死率，对糖尿病的研究已经成为世界范围内的热点。

糖尿病动物模型的使用，可以克服人体研究的局限性，大大促进糖尿病的相关研究。

因此，建立简便、安全、可靠而又接近人类糖尿病的动物模型是糖尿病造模研究发展的必然趋势。

动物模型的选择应该遵循以下几点基本原则：①能正确复制所要研究的损伤或病变；②可以多次或用多种方式进行实验；③实验可被别人重复；④在实验中可获取多个活检标本；⑤容易操作并与动物实验设备相适应；⑥有可供实验观察的足够时间…１。

目前糖尿病动物模型的构建有多种方法，包括①实验性糖尿病动物模型：胰腺切除法、化学药物特异性破坏胰岛Ｂ细胞、手术及药物联合制作糖尿病模型、病毒诱导等；②自发性糖尿病动物模型；③转基因糖尿病模型［３Ｉ。

自发性糖尿病动物模型与转基因糖尿病动物模型最接近人类糖尿病，应用价值较高，但动物价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格；实验性糖尿病动物模型则可适应不同实验的要求，模拟糖尿病的不同生理、病理状况，制作方法相对简单，应用更为广泛。

用于实验性糖尿病动物模型诱导的化学药物常用的有两种：ＳＴＺ和四氧嘧啶。

两种药物比较，ＳＴＺ优于四氧嘧啶，具有造模稳定，快速，种属选择性不强，组织毒性相对较小等优点，故ＳＴＺ最为常用Ｌ２Ｊ。

ＳＴＺ是一种广谱抗菌素，具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用，对实验动物的胰岛Ｂ细胞具有高度选择性毒性作用。

其诱导糖尿病的机制可能是通过自由基损伤胰岛Ｂ细胞，使胰岛Ｂ细胞功能受损，胰岛素合成减少，引发糖尿病；同一种系中ＳＴＺ致细胞损伤程度取决于ＳＴＺ的量，低剂量诱导Ｂ细胞ＩＮＳ－１凋亡，高剂量致Ｂ细胞坏死【３Ｊ。

Ｌｅｄｏｕｘ和Ｗｉｌ一４］和Ｐｅｔｔｅｐｈｅｒ等【５］认为，ＳＴＺ对Ｂ细胞的细胞毒作用首先是将其ＤＮＡ碱基上的特殊位点烷基
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化，继而进一步作用于多聚腺苷二磷酸（ＡＤＰ）核糖体合成酶，从而损伤胰岛Ｂ细胞；小剂量注射ＳＴＺ可破坏少量胰岛细胞，死亡胰岛细胞作为抗原被巨噬细胞吞噬，产生Ｔｈｌ刺激因子，使Ｔｈ细胞系占优势而产生白细胞介素（ＩＬ）．２及肿瘤坏死因子（ＩＦＮ）．７，在胰岛局部促使炎性细胞浸润，并活化释放ＩＬｌ、干扰素（ＴＮＦ）一ａ、ＩＦＮ一７及ＮＯ、Ｈ２０２等物质，杀伤细胞。

死亡细胞作为自身抗原，再次递呈给抗原递呈细胞进行处理，释放细胞因子，放大细胞损伤效应，最终导致糖尿病…６。

跚亿诱导的糖尿病因给药方式不同，其成模效果也有所差别。

如采用大剂量一次性注射的给药方法，建立的大鼠模型与人类ｌ型糖尿病相似；如采用小剂量分次给药的方法，建立的大鼠模型与人类２型糖尿病相似。

利用ＳＴＺ诱导糖尿病给药的途径很多，如静脉注射、腹腔注射、皮下注射等。

据沈亚非和徐淼成【７Ｊ研究，通过腹腔或静脉一次性注射给药，均能取得良好的模型复制效果，且各种体征数据差异无统计学意义。

考虑到ＳＴＺ诱导液非常不稳定，在常温下几分钟内就可以分解为可见的气体，故本实验采用腹腔注射给药的方式，操作简单、方便，时间短，确保药效。

本实验选用雄性ＳＤ大鼠，按照６５ｍｇ／ｋｇ体质量通过腹腔一次性注射ＳＴＺ，诱导Ｂ细胞破坏，最终成模。

大鼠注射刚眩ｌ周后测血糖均高于１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ（Ｐ＜０．０５），以后血糖保持在较高水平，并随着病程延长有所提高，同时大鼠均出现多饮、多食、多尿、体质量减轻、易激惹及白内障等表现，符合糖尿病诊断标准。

观察８周，血糖值始终在建模初期高血糖水平上波动，未见到复转。

胰腺常规ＨＥ染色显示：胰岛萎缩，数量减少，分布稀疏，胰岛细胞发生退行性改变，胰岛中Ｂ细胞数量减少、肿胀，胞质着色浅，细胞核固缩，胰岛间质逐步纤维化，进一步证实了我们诱导的糖尿病模型是成功的。

与其他构建实验性糖尿病模型的方法比较，此模型具有制造方法简便、用药量小、药物毒性低、胰岛Ｂ细胞损害特异性高等优点。

近年来国内外已将此模型广泛应用于糖尿病及其并发症研究的各个领域，但这一模型是通过ＳＴＺ直接损伤胰岛Ｂ细胞诱发大鼠糖尿病，其局限性在于大剂量ＳＴＺ能够大面积甚至完全破坏胰岛Ｂ细胞，从而引起血糖急剧升高，大鼠体质量急剧下降，还需要进行深入的研究和探讨。

我们认为在一次性腹腔注射ＳＴＺ复制糖尿病大鼠模型过程应该注意以下事项：①由于ＳＴＺ溶液极其不稳定，应该现配现用，４℃保存。

ＳＴＺ粉剂应一２０℃保存。

②注射前动物应该禁食１２ｈ以上，这样可以减少ＳＴＺ的用量；否则容易造成动物血糖浓度过高，形成酮症酸中毒死亡。

③如果实验期间需要从尾部多次采血，应对伤１２１采取预防感染处理；否则容易出现动物烂尾感染。

④由于我们的实验观察时间较长，当动物血糖浓度＞３０ｍｍｏｌ／Ｌ时，给予动物皮下注射胰岛素，预防酮症酸中毒而死亡。

⑤在动物饲养期间，一定要保证供水充足。

由于成模动物排尿量较多，每天应更换垫料１－－２次，保持干燥。

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（收稿日期：２００８．１１—２８）作者简介：常利民，男，１９７１年２月生，主治医师，唐山钢铁集团有限责任公司医院，０６３０２０。