荧光免疫标记技术PPT课件
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意低温避光保存。
10
-
实验操作
【应用与评价】 ❖ 荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定
及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测， 免疫细胞表面抗原的检测等。
❖ 此方法检测ANA，主要用于初步筛查，具有简便 、快速、敏感等特点。
11
-
讨论分析
提
用什么可以 观察到荧光？
出
为什么有荧
问
光就能做出
题
诊断？
12
展 开 讨 论
-
讨论分析
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免 疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建 立起来的一项技术。
❖该技术的主要优缺点 ❖主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 ❖主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决， 结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
15
-
讨论分析
荧光
➢ 荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的 荧光衰减到一定程度所用时间。
➢ 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 光较长时间的照射后发生的减弱现象。
➢ 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 ➢ 荧光（标记）物质的保存
16
-
讨论分析
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光色素:能够产生明显 荧光并能作为染料使用 的有机化合物称为荧光 色素或荧光染料。用于 标记抗体的荧光色素， 必须具有化学上的活性 基因，能与蛋白质稳定 结合，且不影响标记抗 体的生物活性及抗原抗 体的特异性结合。
23
-
讨论分析
24
-
讨论分析
间接免疫荧光检测自身抗核抗体
14
-
讨论分析
荧光
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一 种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用 的有机化合物，亦称荧光色素。 发生原理---基态 激发态 产生特点：激发---即刻产生
停止激发---瞬间消失 种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光
协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通的能力
2
-
任务对象
1
荧光标 记物的 制备
2
荧光免 疫组织 化学技
术
3
其他荧 光免疫 技术
3
-
任务过程
复习提问
2′
教
案例导入
2′
学
讲解与示教 30′
环 节
学生操作ห้องสมุดไป่ตู้
40′
讨论分析
10′
评价、考核 5′
课后思考题
1′
4
-
案例导入
患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3天。体 温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊 断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天 ，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性 刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理 增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。 患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快 速诊断？
❖ 4.取出玻片，吹干，加50μl最适工作浓度的标记抗体， 平置于湿盒内，37oC温箱反应30min。
❖ 5.重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体。
❖ 6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。
8
-
实验实验操操作作
【结果判断】
❖ 1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性； 反之为阴性。
❖ 2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型： ❖ ⑴均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。 ❖ ⑵周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或
无荧光。 ❖ ⑶斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。 ❖ ⑷核仁型：核仁部分呈现荧光。
9
-
实验操作
【注意事项】
❖ 1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片 。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒 内，防止干燥。
❖ 2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。 ❖ 3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注
7
-
实验操作
【操作方法】
❖ 1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈 标记。
❖ 2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量 加样器加50μl待检血清或对照血清于基质片上，水平置 于湿盒中37oC温箱反应30min。
❖ 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 中，反复漂洗3次，每次5min。
13
-
讨论分析
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但 不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗 体复合物及其存在部位。
任务八 荧光免疫标记技术
任务目标
1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在 医学检验中的应用
2.熟悉荧光的基础知知识识目、荧标光免疫分析常用仪器
和设备 3.了解荧光抗体的制备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备
2.会用荧光免疫技技术能检目测抗标原抗体
3.能将荧光免疫测定与临床应用相联系
通过学生相互鼓励素、质严目谨、标认真操作，各小组共同
635nm 四荧光参 数 分选、浓 缩系统
21
-
讨论分析
大型机---FACSVantage SE
多激光多 波长八荧光 参数高速分 选单细胞点 对点分选
22
-
讨论分析
荧光免疫显微技术
❖ 基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本 （组织或细胞中Ag)
❖ 技术类型： ➢ 直接法---荧光素标记Ab直接检测 重点 ➢ 间接法---荧光素标记二抗 ➢ 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab ➢ 双结合法---两种荧光素标记Ab
5
-
学生操作
一位学生 操作演示
老师纠正 点评
学生分组 再操作
6
-
实验操作
【主要试剂与器材】 1.抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。 2.标记抗体 FITC标记的羊抗人IgG，有商品化试剂供
应。临用时稀释至工作浓度。 3.0.01mol/L pH7.2PBS。 4.缓冲甘油 9份甘油和1份PBS混匀。 5.待检血清，阴性、阳性对照血清。 6.其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。
17
-
讨论分析
荧光FITC+RB200标记
18
-
讨论分析
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯、 卤素灯
1 滤板：隔热滤板、激 光滤板（UG、BG）、 吸收滤板（OG、GG）
2 光路：透射光、落射 光
19
-
讨论分析
a 透射光
b 落射光
20
-
讨论分析
荧光显微镜台式机---FACSCalibur
双激光--488nm
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实验操作
【应用与评价】 ❖ 荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定
及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测， 免疫细胞表面抗原的检测等。
❖ 此方法检测ANA，主要用于初步筛查，具有简便 、快速、敏感等特点。
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讨论分析
提
用什么可以 观察到荧光？
出
为什么有荧
问
光就能做出
题
诊断？
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展 开 讨 论
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讨论分析
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免 疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建 立起来的一项技术。
❖该技术的主要优缺点 ❖主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 ❖主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决， 结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
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讨论分析
荧光
➢ 荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的 荧光衰减到一定程度所用时间。
➢ 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 光较长时间的照射后发生的减弱现象。
➢ 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 ➢ 荧光（标记）物质的保存
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讨论分析
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光色素:能够产生明显 荧光并能作为染料使用 的有机化合物称为荧光 色素或荧光染料。用于 标记抗体的荧光色素， 必须具有化学上的活性 基因，能与蛋白质稳定 结合，且不影响标记抗 体的生物活性及抗原抗 体的特异性结合。
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讨论分析
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讨论分析
间接免疫荧光检测自身抗核抗体
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讨论分析
荧光
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一 种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用 的有机化合物，亦称荧光色素。 发生原理---基态 激发态 产生特点：激发---即刻产生
停止激发---瞬间消失 种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光
协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通的能力
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任务对象
1
荧光标 记物的 制备
2
荧光免 疫组织 化学技
术
3
其他荧 光免疫 技术
3
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任务过程
复习提问
2′
教
案例导入
2′
学
讲解与示教 30′
环 节
学生操作ห้องสมุดไป่ตู้
40′
讨论分析
10′
评价、考核 5′
课后思考题
1′
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案例导入
患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3天。体 温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊 断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天 ，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性 刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理 增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。 患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快 速诊断？
❖ 4.取出玻片，吹干，加50μl最适工作浓度的标记抗体， 平置于湿盒内，37oC温箱反应30min。
❖ 5.重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体。
❖ 6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。
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实验实验操操作作
【结果判断】
❖ 1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性； 反之为阴性。
❖ 2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型： ❖ ⑴均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。 ❖ ⑵周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或
无荧光。 ❖ ⑶斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。 ❖ ⑷核仁型：核仁部分呈现荧光。
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实验操作
【注意事项】
❖ 1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片 。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒 内，防止干燥。
❖ 2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。 ❖ 3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注
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实验操作
【操作方法】
❖ 1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈 标记。
❖ 2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量 加样器加50μl待检血清或对照血清于基质片上，水平置 于湿盒中37oC温箱反应30min。
❖ 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 中，反复漂洗3次，每次5min。
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讨论分析
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但 不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗 体复合物及其存在部位。
任务八 荧光免疫标记技术
任务目标
1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在 医学检验中的应用
2.熟悉荧光的基础知知识识目、荧标光免疫分析常用仪器
和设备 3.了解荧光抗体的制备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备
2.会用荧光免疫技技术能检目测抗标原抗体
3.能将荧光免疫测定与临床应用相联系
通过学生相互鼓励素、质严目谨、标认真操作，各小组共同
635nm 四荧光参 数 分选、浓 缩系统
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讨论分析
大型机---FACSVantage SE
多激光多 波长八荧光 参数高速分 选单细胞点 对点分选
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讨论分析
荧光免疫显微技术
❖ 基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本 （组织或细胞中Ag)
❖ 技术类型： ➢ 直接法---荧光素标记Ab直接检测 重点 ➢ 间接法---荧光素标记二抗 ➢ 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab ➢ 双结合法---两种荧光素标记Ab
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学生操作
一位学生 操作演示
老师纠正 点评
学生分组 再操作
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实验操作
【主要试剂与器材】 1.抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。 2.标记抗体 FITC标记的羊抗人IgG，有商品化试剂供
应。临用时稀释至工作浓度。 3.0.01mol/L pH7.2PBS。 4.缓冲甘油 9份甘油和1份PBS混匀。 5.待检血清，阴性、阳性对照血清。 6.其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。
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讨论分析
荧光FITC+RB200标记
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讨论分析
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯、 卤素灯
1 滤板：隔热滤板、激 光滤板（UG、BG）、 吸收滤板（OG、GG）
2 光路：透射光、落射 光
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讨论分析
a 透射光
b 落射光
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讨论分析
荧光显微镜台式机---FACSCalibur
双激光--488nm