白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质
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我们筛选到的一株白腐菌能够产生漆酶 ,对此 菌产生的漆酶进行了分离纯化 ,对其酶学性质也进 行了初步研究 ,为以后的应用奠定了基础.
1 材料与方法
111 试剂 Bio2gel P2100 , DEAE2Sephadex A250 ,等电聚焦标
收稿日期 :2001212205 ,接受日期 :2002202208 国家自然科学基金资助项目 (No. 20077015) 3 联系人 Tel : (0531) 8565234 E2mail :lifezds @sdu. edu. cn 康从宝 ,男 ,1974 年 12 月生 ,硕士 Received :December 5 ,2001 ;Accepted :February 8 ,2002 Supported by National Natural Sciences Foundation of China (No. 20077015) 3 Corresponding author Tel : (0531) 8565234 E2mail :lifezds @sdu. edu. cn
1514
250617
117 酶学性质的检测[7] 11711 分子量的测定 将样品及已知分子量的标 准蛋白进行 SDS2PAGE ,然后以相对迁移率做图 ,从 图中可以求出漆酶的分子量. 11712 等电点的测定 将样品及已知 p I 值的标准 蛋白进行等电聚焦电泳 ,得到酶的等电点. 11713 动为学常数 Km 值的测定 酶液与不同浓 度的底物反应后测其酶活力. 用 Linewear2Burk 作图 法求出酶对该底物的 Km 值. 11714 温度对漆酶活性及热稳定性的影响 在不 同温度下按常规法测定其酶活力. 酶液在不同温度 下保温 30 min 后仍按常规法测定其对应的酶活力. 11715 pH 对漆酶活性的影响 分别采用不同 pH 值的缓冲液配制底物和稀释酶液 ,按常规方法测酶 活力. 11716 金属离子对酶活的影响 在酶的反应液中 加入不同的金属离子 ,使其终浓度为 5 mmolΠL ,然后 接常规方法测酶活力. 11717 漆酶对不同染料脱色率计算[8] 在染料溶 液中加入定量的纯化酶液 ,使溶液的染料终浓度为 013 gΠL ,酶活力为 40 UΠml ,作用 6 h 后 ,用 UV2240 在 染料的最大吸收波长处测吸光度 , 得到吸光度为 A1 ;用同样的方法在染料溶液中加入等量的 100 ℃ 灭活 10 min 的酶液作对照 ,测得其吸光度为 A0 ,则 酶对染料的脱色率为 rD % = ( A0 - A1 ) ΠA0 ×100 %.
将粗酶液在 4 ℃超滤 (截留 Mr = 110 ×104 ) 浓缩
后 ,加样到 Bio2gel P2100 (116 cm ×100 cm) 凝胶过滤 层析柱上 ,分次加样量 2～3 ml. 用 pH 值为 418 的 HAc2NaAc 缓冲液洗脱 ,控制流速为 015 mlΠmin. 按每 官 10 ml 收集有酶活的部分 ,经透析 、冷冻浓缩后 , 加样到 DEAE2Sephadex A250 离子交换层析柱上 ,用 含有 NaCl 的缓冲液洗脱 ,NaCl 的浓度梯度为 0～015 molΠL , 收集有酶活的部分 , 经冷冻干燥浓缩后 , 用 SDS2PAGE 对纯化的酶蛋白进行酶蛋白的纯度检测. Table 1 Purification of laccase from W21
(1) State Key Laboratory of Microbial Technology , Shandong University , Jinan 250100 , China ; 2) Department of Petroleum Engineering , Daqing Petroleum Institute , Anda 151400 , China)
Purification procedure
Total protein Πmg
Total activity ΠU
Crude extract
Байду номын сангаас
1500
18000
Ultrafiltration
873
15384
Bio2gel P2100 chromatography
7912
7520
DEAE2cellulose chromatography
ISSN 100727626 CN 1123870ΠQ
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2002 年 10 月 18 (5) :638～642
白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质
康从宝1) ,2) , 刘 巧1) , 李清心1) , 曲音波1) 3 , 高培基1)
2 结 果
211 漆酶的分离和纯化 漆酶粗酶经过超滤浓缩 、分子筛和离子交换层
析纯化后 ,大部分杂蛋白已被除去. 整个分离过程的 纯化结果见 Table 1. Fig11 为漆酶的 DEAE2Sephadex A250 洗脱曲线. 粗酶液经纯化后 ,所得样品的比活 力为 16217 UΠmg , 纯 化 倍 数 为 1315 , 活 力 回 收 为 1319 %. 该酶经 DEAE2Sephadex A250 分离后所得到 的样品经 SDS 及 IEF2PAGE ( Fig12 , Fig13) 检测只显 示一条带 ,表明纯化的漆酶为单一组分.
在 310 ml 反应体中含 2188 ml 012 mmolΠL 柠檬 酸2柠檬酸钠缓冲液 (pH315) ,加入 60 μl 的酶液 ,60 μl 10 mmolΠL 的 DMP(2 ,62二甲氧基酚) ,反应温度为 30 ℃,在 470 nm 处测定光吸收的变化 ,以每分钟氧 化 1μmol 的 DMP 成为 3 ,5 ,3’,5’2四甲氧基二苯醌 (ε= 4916 mmol - 1 ·L·cm- 1 ) 所需要的酶量定义为 1 个 酶活力单位. 114 蛋白浓度的测定
第5期
康从宝等 :白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质
639
准蛋白 (p I 范围 3～10) 为 Pharmacia 产品 ;牛血清白 蛋白 , 低 分 子 量 标 准 蛋 白 ( 分 子 量 范 围 14 000 ～ 94 700) 为国产 ; RB 亮蓝为 Sigma 公司产品 ;其它染 料为国产. 其它试剂为国产分析纯. 菌种为实验室分 离到的一株白腐菌 ( Rigidoporus Lignosus) ,记作 W21 。 112 培养基
(1) 山东大学微生物技术国家重点实验室 ,济南 250100 ;
2) 大庆石油学院石油工程系 ,安达 151400)
摘要 对白腐菌 W21 产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩 、分子筛和离子交换层析进行纯化. 用 SDS2 PAGE 证明该酶的分子量大约为 6214 kD. 等电聚焦电泳显示该酶的等电点为 315. 酶反应的最适温 度为 50 ℃,最适 pH 值为 415. 此酶氧化 DMP 的 Km 值为 3184 ×10 - 5 molΠL. 金属离子对酶活的影响 很大 ,其中 K+ 、Mn2 + 、Ag + 对酶活有促进作用 , Fe2 + 、Fe3 + 、Hg2 + 、Co2 + 、Ba2 + 等对酶活有明显的抑制 作用. 酶对部分染料也有一定的脱色效果. 关键词 白腐菌 ,漆酶 ,纯化 ,酶学性质 中图分类号 Q936
Abstract The laccase was purified from a white rot fungus by ultrafiltration , Bio2gel P2100 and DEAE2Seph2 adex A250 chromatography. The molecular weight of the purified laccase was determined as about 6214 kD by SDS2PAGE. Its p I was determined to be 315 by IFE2PAGE. The optimum pH and temperature for laccase ac2 tivity were 415 and 50 ℃, respectively. The laccase catalyzed the oxidation of 2 ,62dimethoxyphenol with a Michaelis constant of 3184 ×10 - 5 molΠL. Various metal ions showed different effects on the activity. The ac2 tivity was enhanced by K+ , Mn2 + and Ag+ ,and was strongly inhibited by Fe2 + , Fe3 + , Hg2 + , Co2 + and Ba2 + . The laccase also had the ability to decolorize some dyes such as Remazol brilliant blue R and car2 moi sine . Key words white rot fungus , laccase , purification , enzymatic properties
漆酶 ( EC 1. 10. 3. 2) 是一种含铜的氧化酶. 在催 化底物的氧化反应过程中 ,以分子氧作为电子受体. 漆酶广泛存在于自然界的多种植物和菌类的分泌物 中[1] . 按其来源可分为漆树漆酶 (rhus laccase) 和真菌 漆酶 (fungal laccase) 两大类. 近年来又发现漆酶也存 在于细菌中. 漆酶除了能氧化木素以外 ,还被证明能 催化多种底物 ,如酚类化合物及其衍生物 、芳胺及其 衍生物 、羧酸及甾体激素等. 由于许多漆酶氧化的底 物为环境污染物 ,因此 , 漆酶在环境保护中有很好 的应用前景[2 ,3] .
(i) 固体培养基 :PDA 培养基. (ii) 产酶培养基 : 葡萄糖 5 g ,麸皮 5 g ,NaH2 PO4 315 g , K2 HPO4 510 g ,
(NH4 ) SO4 215 g ,MgSO4 012 g ,NaCl 011 g ,加水定容
至 1 L ,调 pH 值至 610. 113 漆酶酶活性的测定[ 1 ,4]
Purification and Properties of Laccase Produced from
a White Rot Fungus ( W21)
KANG Cong2bao1) ,2) , LIU Qiao1) , LI Qing2xin1) , QU Yin2bo1) 3 , GAO Pei2ji1)
Specific activity ΠU·mg - 1 12 1813 9419 16217
Purification fold 110 1153 718 1315
Activity recovery ( %) 100 8514 4118 1319
640
中国生物化学与分子生物学报
18 卷
Bonomo[9] 等人报道的漆酶同工酶 D 分子量相似. 从 Fig13 我们可以看出 ,此漆酶的等电点大约等于或低 于 315. 21212 动力学 Km 值 我们采用 DMP 作为漆酶底 物 ,在 30 ℃、pH 值为 415 的条件下取不同浓度的 DMP(S) ,测得反应速度 ( v) ,得到 1Πv 与 1Π[ S]的关系 曲线见 Fig14 ,从而得到漆酶对 DMP 的 Km 值为 3184 ×10 - 5 molΠL .
按参考文献[ 5 ]进行 ,以牛血清蛋白作为标准蛋 白质. 115 粗酶液的制备
将在固体培养基上培养 7 d 的 W21 挖块接种于 产酶培养基中 ,置于 28 ℃、160 rΠmin 的摇床上培养 6 d ,发酵液于 8 000 rΠmin 下离心 5 min ,取上清液即 可. 116 漆酶的纯化[6]
1 材料与方法
111 试剂 Bio2gel P2100 , DEAE2Sephadex A250 ,等电聚焦标
收稿日期 :2001212205 ,接受日期 :2002202208 国家自然科学基金资助项目 (No. 20077015) 3 联系人 Tel : (0531) 8565234 E2mail :lifezds @sdu. edu. cn 康从宝 ,男 ,1974 年 12 月生 ,硕士 Received :December 5 ,2001 ;Accepted :February 8 ,2002 Supported by National Natural Sciences Foundation of China (No. 20077015) 3 Corresponding author Tel : (0531) 8565234 E2mail :lifezds @sdu. edu. cn
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117 酶学性质的检测[7] 11711 分子量的测定 将样品及已知分子量的标 准蛋白进行 SDS2PAGE ,然后以相对迁移率做图 ,从 图中可以求出漆酶的分子量. 11712 等电点的测定 将样品及已知 p I 值的标准 蛋白进行等电聚焦电泳 ,得到酶的等电点. 11713 动为学常数 Km 值的测定 酶液与不同浓 度的底物反应后测其酶活力. 用 Linewear2Burk 作图 法求出酶对该底物的 Km 值. 11714 温度对漆酶活性及热稳定性的影响 在不 同温度下按常规法测定其酶活力. 酶液在不同温度 下保温 30 min 后仍按常规法测定其对应的酶活力. 11715 pH 对漆酶活性的影响 分别采用不同 pH 值的缓冲液配制底物和稀释酶液 ,按常规方法测酶 活力. 11716 金属离子对酶活的影响 在酶的反应液中 加入不同的金属离子 ,使其终浓度为 5 mmolΠL ,然后 接常规方法测酶活力. 11717 漆酶对不同染料脱色率计算[8] 在染料溶 液中加入定量的纯化酶液 ,使溶液的染料终浓度为 013 gΠL ,酶活力为 40 UΠml ,作用 6 h 后 ,用 UV2240 在 染料的最大吸收波长处测吸光度 , 得到吸光度为 A1 ;用同样的方法在染料溶液中加入等量的 100 ℃ 灭活 10 min 的酶液作对照 ,测得其吸光度为 A0 ,则 酶对染料的脱色率为 rD % = ( A0 - A1 ) ΠA0 ×100 %.
将粗酶液在 4 ℃超滤 (截留 Mr = 110 ×104 ) 浓缩
后 ,加样到 Bio2gel P2100 (116 cm ×100 cm) 凝胶过滤 层析柱上 ,分次加样量 2～3 ml. 用 pH 值为 418 的 HAc2NaAc 缓冲液洗脱 ,控制流速为 015 mlΠmin. 按每 官 10 ml 收集有酶活的部分 ,经透析 、冷冻浓缩后 , 加样到 DEAE2Sephadex A250 离子交换层析柱上 ,用 含有 NaCl 的缓冲液洗脱 ,NaCl 的浓度梯度为 0～015 molΠL , 收集有酶活的部分 , 经冷冻干燥浓缩后 , 用 SDS2PAGE 对纯化的酶蛋白进行酶蛋白的纯度检测. Table 1 Purification of laccase from W21
(1) State Key Laboratory of Microbial Technology , Shandong University , Jinan 250100 , China ; 2) Department of Petroleum Engineering , Daqing Petroleum Institute , Anda 151400 , China)
Purification procedure
Total protein Πmg
Total activity ΠU
Crude extract
Байду номын сангаас
1500
18000
Ultrafiltration
873
15384
Bio2gel P2100 chromatography
7912
7520
DEAE2cellulose chromatography
ISSN 100727626 CN 1123870ΠQ
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2002 年 10 月 18 (5) :638～642
白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质
康从宝1) ,2) , 刘 巧1) , 李清心1) , 曲音波1) 3 , 高培基1)
2 结 果
211 漆酶的分离和纯化 漆酶粗酶经过超滤浓缩 、分子筛和离子交换层
析纯化后 ,大部分杂蛋白已被除去. 整个分离过程的 纯化结果见 Table 1. Fig11 为漆酶的 DEAE2Sephadex A250 洗脱曲线. 粗酶液经纯化后 ,所得样品的比活 力为 16217 UΠmg , 纯 化 倍 数 为 1315 , 活 力 回 收 为 1319 %. 该酶经 DEAE2Sephadex A250 分离后所得到 的样品经 SDS 及 IEF2PAGE ( Fig12 , Fig13) 检测只显 示一条带 ,表明纯化的漆酶为单一组分.
在 310 ml 反应体中含 2188 ml 012 mmolΠL 柠檬 酸2柠檬酸钠缓冲液 (pH315) ,加入 60 μl 的酶液 ,60 μl 10 mmolΠL 的 DMP(2 ,62二甲氧基酚) ,反应温度为 30 ℃,在 470 nm 处测定光吸收的变化 ,以每分钟氧 化 1μmol 的 DMP 成为 3 ,5 ,3’,5’2四甲氧基二苯醌 (ε= 4916 mmol - 1 ·L·cm- 1 ) 所需要的酶量定义为 1 个 酶活力单位. 114 蛋白浓度的测定
第5期
康从宝等 :白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质
639
准蛋白 (p I 范围 3～10) 为 Pharmacia 产品 ;牛血清白 蛋白 , 低 分 子 量 标 准 蛋 白 ( 分 子 量 范 围 14 000 ～ 94 700) 为国产 ; RB 亮蓝为 Sigma 公司产品 ;其它染 料为国产. 其它试剂为国产分析纯. 菌种为实验室分 离到的一株白腐菌 ( Rigidoporus Lignosus) ,记作 W21 。 112 培养基
(1) 山东大学微生物技术国家重点实验室 ,济南 250100 ;
2) 大庆石油学院石油工程系 ,安达 151400)
摘要 对白腐菌 W21 产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩 、分子筛和离子交换层析进行纯化. 用 SDS2 PAGE 证明该酶的分子量大约为 6214 kD. 等电聚焦电泳显示该酶的等电点为 315. 酶反应的最适温 度为 50 ℃,最适 pH 值为 415. 此酶氧化 DMP 的 Km 值为 3184 ×10 - 5 molΠL. 金属离子对酶活的影响 很大 ,其中 K+ 、Mn2 + 、Ag + 对酶活有促进作用 , Fe2 + 、Fe3 + 、Hg2 + 、Co2 + 、Ba2 + 等对酶活有明显的抑制 作用. 酶对部分染料也有一定的脱色效果. 关键词 白腐菌 ,漆酶 ,纯化 ,酶学性质 中图分类号 Q936
Abstract The laccase was purified from a white rot fungus by ultrafiltration , Bio2gel P2100 and DEAE2Seph2 adex A250 chromatography. The molecular weight of the purified laccase was determined as about 6214 kD by SDS2PAGE. Its p I was determined to be 315 by IFE2PAGE. The optimum pH and temperature for laccase ac2 tivity were 415 and 50 ℃, respectively. The laccase catalyzed the oxidation of 2 ,62dimethoxyphenol with a Michaelis constant of 3184 ×10 - 5 molΠL. Various metal ions showed different effects on the activity. The ac2 tivity was enhanced by K+ , Mn2 + and Ag+ ,and was strongly inhibited by Fe2 + , Fe3 + , Hg2 + , Co2 + and Ba2 + . The laccase also had the ability to decolorize some dyes such as Remazol brilliant blue R and car2 moi sine . Key words white rot fungus , laccase , purification , enzymatic properties
漆酶 ( EC 1. 10. 3. 2) 是一种含铜的氧化酶. 在催 化底物的氧化反应过程中 ,以分子氧作为电子受体. 漆酶广泛存在于自然界的多种植物和菌类的分泌物 中[1] . 按其来源可分为漆树漆酶 (rhus laccase) 和真菌 漆酶 (fungal laccase) 两大类. 近年来又发现漆酶也存 在于细菌中. 漆酶除了能氧化木素以外 ,还被证明能 催化多种底物 ,如酚类化合物及其衍生物 、芳胺及其 衍生物 、羧酸及甾体激素等. 由于许多漆酶氧化的底 物为环境污染物 ,因此 , 漆酶在环境保护中有很好 的应用前景[2 ,3] .
(i) 固体培养基 :PDA 培养基. (ii) 产酶培养基 : 葡萄糖 5 g ,麸皮 5 g ,NaH2 PO4 315 g , K2 HPO4 510 g ,
(NH4 ) SO4 215 g ,MgSO4 012 g ,NaCl 011 g ,加水定容
至 1 L ,调 pH 值至 610. 113 漆酶酶活性的测定[ 1 ,4]
Purification and Properties of Laccase Produced from
a White Rot Fungus ( W21)
KANG Cong2bao1) ,2) , LIU Qiao1) , LI Qing2xin1) , QU Yin2bo1) 3 , GAO Pei2ji1)
Specific activity ΠU·mg - 1 12 1813 9419 16217
Purification fold 110 1153 718 1315
Activity recovery ( %) 100 8514 4118 1319
640
中国生物化学与分子生物学报
18 卷
Bonomo[9] 等人报道的漆酶同工酶 D 分子量相似. 从 Fig13 我们可以看出 ,此漆酶的等电点大约等于或低 于 315. 21212 动力学 Km 值 我们采用 DMP 作为漆酶底 物 ,在 30 ℃、pH 值为 415 的条件下取不同浓度的 DMP(S) ,测得反应速度 ( v) ,得到 1Πv 与 1Π[ S]的关系 曲线见 Fig14 ,从而得到漆酶对 DMP 的 Km 值为 3184 ×10 - 5 molΠL .
按参考文献[ 5 ]进行 ,以牛血清蛋白作为标准蛋 白质. 115 粗酶液的制备
将在固体培养基上培养 7 d 的 W21 挖块接种于 产酶培养基中 ,置于 28 ℃、160 rΠmin 的摇床上培养 6 d ,发酵液于 8 000 rΠmin 下离心 5 min ,取上清液即 可. 116 漆酶的纯化[6]