多环芳烃降解菌的获得及应用

应用与环境生物学报　2003,9(6):639～641 Chin J Appl Environ Biol=ISSN10062687X　2003212225

多环芳烃降解菌的获得及应用3

韩清鹏33　方 秦利峰　王平

(浙江大学生物医学工程系　杭州　310027)

摘　要　运用双相(水-硅油)系统可进行有机物降解菌的筛选.本实验用此法获得了多环芳烃(PAHs)的降解菌,降解菌对PAHs有较好的降解作用.堆肥法处理PAHs中接入筛选到的降解菌可以大大加强降解效果.堆肥过程中堆温升高很快,对一些PAHs如荧蒽、芘、苯并[a]芘等可以彻底清除,对更多环的PAHs也可降到很低的浓度.图1表3参4

关键词　多环芳烃;降解;水-硅油系统

C LC　X172

PAH s2DEGRADING MICROORGANISMS AN D THEIR APPL ICATION3

HAN Qingpeng33,FAN G Fang,Q IN Lifeng&WAN G Ping

(Biomedical College,Zhejiang U niversity,Hangzhou　310027,China)

Abstract　The biphasic aqueous-organic system(water-silicon oil system)is useful to select the microorganisms degrading PAHs.The degrading microorganisms were obtained in the experiment and were inoculated in compost to degrade PAHs.

The degrading effect was evident.While composting temperature raised quickly.S ome PAHs could be degraded thoroughly but some PAHs with more rings could also be degraded in a fairly low level.Fig1,Tab3,Ref4

K eyw ords　PAHs;degrade;biphasic system;compost

C LC　X172

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,简称PAHs)主要来源于煤焦油、杂酚油和石油以及有机质不完全燃烧而产生的污染物.由于它们在环境中的化学稳定性高、水溶性低且长期残留,致癌致畸且有毒,因此解决这类化合物引起的污染问题是非常有意义的.

多环芳烃理化性质不相同,反映出的生物降解性也各不相同.一般说来,多环芳烃的降解性随苯环数量的增加而降低,三环以下的易于降解,四环以上的较难降解[1].

研究多环芳烃这一类难降解有机物的生物降解过程,首要问题是筛选降解菌.只有分离到降解菌后,才能作进一步的理论研究和用于生物修复PAHs的污染.用一种水-硅油双相系统可进行对PAHs类难降解物质的降解菌的富集、筛选[2,3].把获得的降解菌接入多环芳烃污染的堆肥中可加速多环芳烃的降解.本文研究了用水-硅油双相系统筛选多环芳烃降解菌,并把降解菌用于含有PAHs的污染物中进行堆肥处理.

1　材料与方法

1.1　多环芳烃的来源

某化工厂的工业废物酸焦油,系有机液体和固体混合物,其中固体废渣占36.3%(质量分数),酸焦油为1719～19536 mg/kg,其中苯并芘(B[a]P)为3567mg/kg,15种PAHs含量之和为96999mg/kg,占酸焦油总量的9.7%.酸焦油用φ= 1/11的甲苯溶解.

收稿日期:2002210211 接受日期:2002212203

3国家自然科学基金资助项目(No:29577269)　Supported by the Na2 tional Natural Science Foundation of China

33通讯作者　Corresponding author 1.2　水-硅油两相系统组分

硅油系高纯度的液体,成分为聚二甲基硅氧烷醇,分子量2000左右,运动粘性系数20×10-2m2/s,密度为0.95,表面张力为20.6×10-5N/cm,阶电常数为2.72.

无机盐培养液配方如下(ρ/mg L-1):K2HPO4775, KH2PO4350,(NH4)2SO4・7H2O100,FeSO4・7H2O1,MnSO4・H2O1,Na2MoO40.21,CaCl240(培养基1)[3].

1.3　富集降解菌的方法

在水-硅油系统中富集.每个250mL的三角瓶中加入80 mL的无机盐培养液和20mL的硅油,加入待降解物作为碳源,加入污染物作为菌源,室温30℃下培养,振荡速度为120 r/min.经过一段时间的生长后,可见液体浑浊而且p H下降,取5mL的上述液体加入另外一个装有同样物质的三角瓶,作为对照(CK)[3].

1.4　PAHs降解菌的分离

在无机盐固体培养基上涂布菌液.然后喷涂溶有PAHs的乙醚溶液,乙醚很快挥发,PAHs留在培养基上,PAHs的浓度与水-硅油系统富集PAHs降解菌时的PAHs浓度相同.待菌长出后,进一步纯化菌种,保存.

1.5　混合菌在水-硅油系统中对PAHs的降解效果

的测定

在含有PAHs的水-硅油系统中接入活化的PAHs降解菌,15d后用HPLC色谱仪测定PAHs的残留.

1.6　用堆肥法结合接种降解菌处理多环芳烃中的实验

以鸡粪和树叶及土壤为原料堆肥(C N=25 1).堆肥容器为圆筒形容器(内径20cm,高65cm).由于堆肥体积小,为了

避免堆肥堆温上升后热量的散失,外用木屑保温,顶部使用具

孔的盖子盖顶,起到保温遮光的作用,同时也可满足通气的要求.往堆肥中加入酸焦油的浓度为280mg/kg ,同时接入5%左右的降解菌(液体培养3～5d 后)接入堆肥中,监测堆肥温度的变化,在堆肥初期、升温期末、高温期末、降温期末和腐熟期末翻堆、采样,测定水分变化,并将水分含量控制在60%左右.1.7　堆肥样品的提取和浓缩[4]

称取1.00g 污染样物置于10mL 具塞玻璃离心管中.加入2.00g 的无水Na 2SO 4混匀,加入10mL 混合溶剂(V 二氯甲烷 V 丙酮=2 1),放置75～90min ,超声提取20min ,以2500r/

min ,离心5min ,将上清夜转移至T 2D 浓缩管,再往离心管中

加入8mL 混合溶剂,放置60min ,超声提取15min ,以2500r/min ,离心3min ,将上清夜与上次提取液合并K 2D 浓缩管中,用常量、微量Snyder 柱浓缩至1.0mL 以下(水浴温度69～

75℃

),用丙酮定溶至1.0mL ,过滤,同时进行溶剂空白实验.所有操作均在避光条件下进行.同时称取2.00g 的样品,测定样品的含水量.

1.8　多环芳烃的测定方法

分析仪器为岛津LC100型液相色谱仪,紫外线检测器,波长为254nm ,样品分析时间为30min ,打印时间为60min ,进样过程:B 泵水流速为0.1mL/min ,A 泵甲醇流速为0.4mL/min ,进样11min 后梯度洗脱40min 洗完.标准样品:16种多环芳烃标准储备液.用保留时间和峰高测定PAHs ;以PAHs 混合标准液为外标,定量计算PAHs 的浓度.

2　结果与讨论

2.1　利用水-硅油系统筛选PAHs 降解菌

2.1.1　降解菌的富集和分离 在上述水-硅油两相系统中

富集得到降解菌.每隔3d 测定微生物数目,选用含葡萄糖的培养基培养,获得总菌数.微生物生长见表1.

表1　水-硅油系统富集PAHs 降解菌不同时间微生物的生长

Table

1　Growth of PAHs 2degrading microorganisms

in the biphasic system

t /d 03691215n /mL

-1

5×10

6

5×10

6

1×10

7

8×10

7

1.5×10

8

1×108

由表1可知,d 12菌数达到1.5×108mL -1,微生物生长

旺盛.可以进行下一步的分离.在无机盐固体培养基上涂布菌液,然后喷涂溶有PAHs 的乙醚溶液.乙醚随后挥发.待菌长出后,进一步纯化分离,得到三株降解菌,一种为霉菌,两种细菌,待鉴定.先编号为S1,S2,S3.前两株为细菌,后一株为霉菌.2.1.2　降解菌降解效果的测定 在含有多环芳烃的水-硅油两相系统中接入降解菌,培养15d 后,测定降解效果如表2.

由表2可知,从两相系统中筛选得到的降解菌对各种PAHs 均有降解,对环较少的PAH 降解效果较好,如对萘、苊烯、菲、蒽和芴的降解比较彻底.降解菌对环较多的PAHs ,如荧蒽、芘、苯并[a ]芘、苯并[ghi ]北的降解效果就差一些.

运用双相系统在15d 内筛选到了PAHs 降解菌.与别的方法相比,水-硅油系统提供给微生物一个特殊的有机相环境(PAHs 溶解在硅油里面),可以避免PAHs 对微生物的抑制,并

且提高微生物的代谢功能.在此系统中PAHs 的浓度较高

(PAHs 总浓度为1.45g/L ),可以提供充分的碳源和能源,PAHs 是一类理化性质各不相同的物质,因此此降解过程中有共代谢作用和微生物之间的相互作用,在富集中会提高选择的程度.实际应用的菌为混合菌.这与在自然环境中混合菌作用于不同污染物的过程是相似的.

表2　降解菌在水2硅油系统中对PAHs 地降解效果

Table 2　Degradation of PAHs in the biphasic

system by the microorganisms

名称Name

降解菌降解效果Degradation results

非生物降解率Abiotic deg 2radation rate

生物降解率Biological deg 2radation rate

总去除率

Total remov 2

al rate 萘Naphthalene 无No

81.781.7苊烯Acenaphthene 3.796.3100苊+芴Fluerence 2.787.189.8菲Phenanthrene 无No 92.292.2蒽Anthracene 无No 100100荧蒽FA 5.654.359.9芘Pyrene

17.841.359.1苯并[a ]芘B[a ]P

2.854.657.4苯并[ghi ]北B[ghi ]Pe 7.6

30.8

38.4

　3非生物降解率的测定为对照处理,即不接种菌的降解如光解和物

理、化学作用　Indicating CK

2.2　降解菌在堆肥处理多环芳烃的应用

2.2.1　接种降解菌处理PAHs 的堆肥温度变化 本实验中

温度随时间的变化曲线如图1所示.由图1可知,加入降解菌F 0d 2就开始升温,d 4升到30℃以上,d 9达到高温峰值58℃,高温阶段持续6d ,并维持一个动态平衡状态,此时高温菌分解有机物的产热量和堆体的散热量相平衡.可明显看到堆肥发白,质地疏松变轻.加菌的温度曲线有两个峰,前一个峰为降解菌利用堆肥材料的温度峰值,后一个峰为降解菌降解PAHs 时的温度峰值.而不加菌的堆肥对照升温比较缓慢,d 8才升到30℃,且速度缓慢,高温期维持为6d ,最高温度也没有加菌的高,为47℃,原因可能是由于污染基质含量高,造成对土著微生物的危害.而外加降解菌可以迅速适应环境,提前进入启动期,并对多环芳烃进行降解.

图1　堆肥温度随时间变化图

Fig.1　The changing temperature in the course

of composting

2.2.2　PAHs 的降解 在堆肥不同的时期取样,测定PAHs 的降解情况,结果如表

3.

046 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 9卷