免疫佐剂研究进展

免疫佐剂研究进展

摘要：随着疫苗研究的飞速发展，如重组DNA疫苗、合成肽段疫苗等，免疫佐剂的研究越来越受到人们的关注。佐剂可以导致快速而强烈的免疫反应。分析了常用佐剂的应用及其各自的优缺点，并综述了两种新型的免疫佐剂的研究进展。

关键词：免疫；佐剂；疫苗

早在70年前，免疫佐剂就被广泛地应用于生产和研究。佐剂与特异性免疫原本无关，但可非特异性地通过物理的或化学的方式与特异性免疫反应物质结合，从而诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时能减少抗原的用量，节约成本。随着疫苗研究的不断深入，特别是分子生物学技术的迅速发展，研制出的新型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。本文就常用佐剂以及最近深入研究、比较的两种免疫佐剂的研究进展进行了综述。

1 常用免疫佐剂

1.1 铝盐佐剂

铝盐是一种含有Al3+的无机盐，主要有Al(OH)3、AlPO4等。铝盐佐剂的应用非常广泛，是现在唯一被FDA批准的人、兽均可应用的佐剂。铝盐与抗原结合形成抗原贮存库，使抗原得以缓慢稳定地释放。铝盐的应用已有八十年的历史，实践证明是一种有效的诱导免疫反应的佐剂，而且氢氧化铝成本低廉，使用方便、无毒，是胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原的良好免疫佐剂。但它也存在明显的缺陷，主要的不足之处是铝盐佐剂仅能诱导、激发体液免疫，对由胞内病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)等引起的病毒性疾病无法产生有效的细胞免疫[1]。

1.2 氟氏佐剂

氟氏佐剂分为氟氏完全佐剂(FCA)和氟氏不完全佐剂(FIA)两种。FCA是在FIA的基础上加一定量灭活的分枝杆菌而成的，是Th1亚型细胞强有力的激活剂。FCA既能刺激体液免疫，还是细胞免疫的强刺激剂。FIA则仅刺激体液免疫。但弗氏佐剂在使用中可引起慢性肉芽肿和经久不愈的溃疡，造成严重的组织损伤。Wagland等[2]实验证明：在用FCA作为佐剂为猪做免疫时，尽管产生了较高的抗体滴度，却降低了免疫效果。弗氏佐剂的代表性替代品有乳胶类佐剂Ribi和Titer Max，采用了可代谢和无毒的鲨烯作为油剂，以减轻炎症反应。但其实验效果并不稳定[3]。除少数兽用疫苗如口蹄疫疫苗使用FIA外，很少用于动物免疫，更不能用于临床医学。

1.3 脂质体佐剂

脂质体是一层或多层脂质双分子膜以同心圆形式包封而成，兼具佐剂和载体功能，类似细胞膜的微球体。脂质体能将抗原传递给合适的免疫细胞，具有靶向作用。脂质体无毒、无免疫原性，且在体内可降解，是一种较良好的佐剂。在细菌类、病毒类、寄生虫类以及肿瘤类脂质体疫苗的开发中有许多相关报道证实了它的有效性。由N’，N’—二甲基乙二胺基氨甲酰基胆固醇(DC-chol)制备成的正电荷脂质体作为基因转移的载体而被批准用于基因治疗的临床研究。这种正电荷脂质体的表面吸附带负电荷的蛋白质疫苗，增强了疫苗的免疫原性，且其成份简单，制备方便，结构稳定，安全无毒，可望在不久的将来成为继铝佐剂后又一种被批准用于人类疫苗的新型佐剂[4]。易学瑞等[5]用DC-chol制备粒径为50~300nm的正电荷纳米脂质体，作为乙肝疫苗的佐剂，免疫小鼠后进行血清中特异型抗体IgG1、IgG2、脾细胞产生的细胞因子的测定。结果表明，该制剂诱导的特异性抗体以IgG2为主，能诱导高水平的Th1类的细胞因子IL-2、IFN-γ，表明纳米正电荷脂质体将能顺应疫苗研究的发展方向，有助于提高蛋白质疫苗和基因疫苗的细胞免疫效应。

1.4 免疫刺激复合物(ISCOM)

ISCOM是由抗原、皂苷、胆固醇、磷脂组成的疏水性笼状结构。该结构使抗原颗粒化，比可溶性的抗原更易被APC吞噬，能同时活化Th细胞、CTL细胞、B细胞。既能激发细胞免疫，又可激发体液免疫，可产生全面的免疫应答。用ISCOM技术制备的各种兽用细菌、病毒、寄生虫疫苗已有大量研究。Furrie E 等通过给小鼠口饲含卵蛋白(OV A)的ISCOM发现，小鼠肠相关淋巴细胞组织(肠系膜淋巴结MLN和集合淋巴结PP)有炎性细胞募集，即活化的F4/80+巨噬细胞、活化的树突细胞、CD4+T细胞及B220+B淋巴细胞数均明显升高，进一步实验证明，实验组小鼠血清OV A的吸收速度加快，峰值提早，提示ISCOM可通过对抗原摄取和局部辅助细胞的联合影响来增强肠道抗原的免疫原性，具有开发为粘膜佐剂的前景。

1.5 细胞因子

细胞因子是由免疫系统分泌产生的小分子多肽。是用于防御外来微生物的主要免疫介导因子和效应物质。多种细胞因子都具有免疫佐剂的作用。将编码细胞因子的质粒与DNA疫苗共注射时，在不同程度上增强DNA疫苗的免疫效果，并可引导免疫向有利的方向转变。目前用于诱导Th1免疫应答的细胞因子主要是IFN-γ、IL-2、IL-12等，而诱导Th2免疫应答的细胞因子则是IL-4、IL-6、IL-10等，其中以IL-12的研究最为引人注目。IL-12又称为细胞毒性T细胞成熟因子和自然杀伤细胞刺激因子。可作用于NK细胞和T淋巴细胞，是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁。IL-12能强有力地刺激NK细胞，诱导产生IFN-γ，还可刺激原初CD4+T细胞分化为Th1亚群，调节Th1/Th2型应答的平衡，有助于Th1分化优势。同时IL-12还可刺激CD8+T细胞分化为成熟细胞[6]。在寄生虫，特别是胞内寄生虫的感染中，IL-12具有强大的免疫保护作用，已经在利什曼原虫、

疟原虫、弓形虫和血吸虫感染的试验中获取得了一定的效果。

2 两种新型佐剂的开发

2.1 CpG佐剂

CpG是一类以CpG二核苷酸为核心的未甲基化的特殊的DNA序列。CpG ODN作为佐剂，可明显促进Thl型免疫应答的产生。其与不完全弗氏佐剂联合应用时，其效应甚至强于完全弗氏佐剂。即使与Th2型佐剂如氢氧化铝合用亦可明显促进免疫应答的产生，且Thl型应答明显强于Th2型应答。CpG ODN能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞等，间接激活T细胞、NK细胞，诱导以Thl型为主的免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂，在基因疫苗、免疫缺陷性疾病、肿瘤、感染性疾病及过敏性疾病的治疗中有着强大的潜在应用价值。

最初得到的CpG来源于微生物细菌，而且只有非脊椎动物的DNA具有上述生物活性，脊椎动物和植物的则没有。进一步的研究表明，在细胞DNA中，CpG 基序出现的频率为1/16，且是非甲基化的，而在脊椎动物基因组中则以1/50~1/60的低频率表达，其中80%左右的胞嘧啶被甲基化。如果将细菌CpG DNA中的胞嘧啶甲基化，则会失去免疫刺激效应。

脊椎动物免疫系统识别细菌CpG DNA的过程认为比较经典的是NF-κB途径。天然免疫系统细胞表面有一种模型识别受体(PRRS)，该受体能与存在于微生物细胞的分子模型特异性结合，该类分子模型称为病原体相关分子模型(PAMPs)。CpG DNA作为一种PAMP，与细胞膜上负责细胞信号转导的Toll样受体9(TLR-9)特异性结合，在另一种接头蛋白即髓样分化标志物88(MyD88)的参与下，将胞外信号传导至胞内，与胞内靶物质具有丝/苏蛋白激酶活性的IL-1受体相关激酶(IRAK)作用，使IRAK磷酸化，继而与肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6相结合，通过TRAF6使IRAK连接于NF-κB诱导激酶，使NF-κB通路活化，诱导某些基因的特异表达[7]。

这种CpG-DNA/TLR9/MyD88/NF-κB的作用途径一直被认为是CpG作用的主导途径，但Spies[8]等的实验却否定了这一假设。他们将CpG基序插入到质粒骨架区观察表达OV A的质粒的免疫原性。实验结果表明，在体内反复多次的质粒免疫后，OV A特异性CTL的增殖反应在DC TLR9+和TLR9-或MyD88-的小鼠中都一样。这一结果提示，CpG-DNA与免疫细胞的作用方式除了CpG-DNA/TLR9途径外，还可能存在其他模式。

由于CpG DNA的免疫刺激作用存在种属特异性。国内外许多研究者致力于筛选对不同动物最佳免疫刺激性的CpG ODN作为免疫佐剂。景志忠等[9]通过筛选人工合成多种经硫代修饰的CpG ODN序列，对兔、猪、鼠体进行了与铝胶、206佐剂、蜂胶佐剂的配伍和比较实验，结果显示，CpG ODN与铝胶联合各组比相应单一佐剂组的抗体效价增加显著，其中，CpG2的优越性更明显。不仅具有强烈刺激体液免疫的功能，而且强烈刺激细胞免疫。李光富等[10]设计合成了