基因敲除技术研究进展

刘建忠等 : 基因敲除技术研究进展 / 2006 年第 2 期
5 因整合进宿主基因组时的方式多为两头插入 , 根据这 一现象 Mario 设计了长度大于 10 kb的载体, 其中包 含 neoR 基因 , 而在距离发生同源重组较远的位置上有 一个由单纯疱疹病毒基因启动子驱动的胸苷激酶基因 ( H SV2t k) 片段。先用 G418 筛选整合了 经过改造的 载体的克隆, 这是正选择。接下来 , 对于随机整合的克 隆其 t k 基因能得到表达, 可检测到相应的表达产物。 而发生了同源重组的克隆其 H SV2t k 基因经过反复传 代势必丢失, 也就不可能有表达 , 从而检测不到 tk 基 因表达的产物, 即负选择。 2 13 影响同源重组效率的因素 目前报道的影响同源重组效率的因素主要是外源 基因转染的方式。据报道 , 采用显微注射的方法 , 在 经 G418 筛选 出的 克 隆中 , 发 生 同源 重 组的 概率 为 1/ 150, 而采用电转化的方法时 , 经 G418 筛选出的克 隆中 , 发生同源重组的概率仅为 1/ 300。基因敲除的 技术路线见图 1。
将小鼠的卡巴 B 蛋白抑制因子的激酶 1
- /-
( IKK1 ) 基因 敲除 以研 究该 基 因的 功能 , 结 果表 明, IKK 1 个体的表型是正常的, 但 IKK 1 个体出现了 四肢突兀、 头小于正常小鼠、 无外耳、 表皮无皱褶等异 常现象。 IKK -1 / - 个 体 能够 发 育 到出 生 , 但出 生 后 30 min内死亡 , 出生时 IKK -1 / - 个体较正常个体小 , 心 脏、 肺、 肝脏、 脾脏、 脊椎、 头颅均异常。
2003 年 4 月 14 日, 美国联邦国家人类基因组研 究项目负责人在华盛顿宣布, 始于 1990 年的国际人类 基因组计划经美、 英、 日、 法、 德和中国科学家的不懈努 力比原计划提前两年完成。通过实施人 类基因组计 划, 得到了人类几乎全部基因的核苷酸序列, 但对于大 多数基因的功能却知之甚少。基因敲除 ( Gene knock out) 是借助分子生物学、 细胞生物学和动物胚胎学的 方法 , 通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的 正常功能基因的编码区破坏 , 藉以揭示基因功能最直 接的手段之一, 因此成为后基因组时代的重要研究方 法和内容。
的动物个体, 通过行为观察、 生理生化指标检测等手段 可以揭示该基因的作用。 迄今为止, 只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、 效果 最稳定, 因此小鼠是基因敲除研究的唯一的实验动物模 型[ 2] 。
2 基因敲除载体的构建及发生同源重组干细 胞的筛选
2 11 基因敲除载体的构建 构建特定基因的敲除载体必须深入了解该基因的
[ 4] [ 4]
2 12 1 1 Sout hern 杂交 该方法的原理很简单 , 即用特定的限制性内切酶 消化从经过扩增的干细胞中提取的基因组 DNA, 用敲 除载体为探针, 对于发生了同源重组的干细胞克隆和 随机整合了敲除载体的干细胞克隆, 其 Sout hern 杂交 结果不 同 , 杂 交 出 的条 带 有 差 异。 William 等[ 3] 用 pvu II 消化来自每一干细胞克隆的 DNA, 然后与经标 记的敲除载体杂交, 对于随机整合的克隆可以杂交出 一条大小为2 1 0 kb 的条带, 而发生了同源重组的克隆 则杂交出了2 1 0 kb 和2 1 4 kb 的两条带。 2 12 1 2 P CR 扩增 采用在经过改造的载体中插入一小段寡聚核苷酸 ( 约29 bp) 序列 , 该序列正好与基因组基因上的一小 段序列组成一对 P CR 引物, 这样通过 PCR 扩增产物 的大小即可区分同源重组和随机插入。 2 12 1 3 正负选择 该方法筛选同源重组克隆的依据是对于线性化的 外源基因片段无论采用电转化还是显微注射 , 外源基
参考文献 :
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2006, Vol. 23 No. 2
化学与生物 工程
Chemis try & Bioengineering
基因敲除技术研究进展
刘建忠 1 , 敖 敬 1 , 田为宇1 , 马季骅2 ( 1. 武汉科技大学化工与资源环境学院, 湖北 武汉 430081; 2. 武汉科技大学医学院 , 湖北 武汉 430081)
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刘建忠等 : 基因敲除技术研究进展 / 2006 年第 2 期
12 1 5% 的个体表现为单肾 , 表明 Sma d 3 基因对小鼠肾 脏的形成有一定的影响。
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目前存在的主要问题
基因敲除研究中存在 的主要问题有 以下几个方 面: 其一, 基因定向敲除的成功率很低, 检测发生同源 重组干细胞的工作比较困难。其二, 尽管小鼠的繁殖 周期为 19~ 21 d, 但从定向敲除干细胞基因到筛选出 具备理想基因型的基因敲除小鼠模型依旧耗时极长。 其三 , 基因敲除后的功能可能被其它基因的代偿作用 填补 , 因此并不表现表型缺陷。
[ 4]
Fig. 1
图 1 基因敲除的技术路线 The technical route for gene knock out
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基因敲除动物模型的建立
Eddy 等
[ 5]
显差别。这样的公鼠与经雌激素处理过的母鼠混养过 夜, 能见到阴栓的个体极少。 ERKO 公鼠由于雌激素 受体基因缺失出现了交配频率降低、 精子数量减少、 精 子发生紊乱等现象。 Hu 等
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基因敲除的细胞基础 ) ) ) 胚胎干细胞
结构组成 , 如组成该基因的核苷酸序列、 外显子和内含 子数目、 特定位点的限制性内切酶的种类以及该基因 在染色体上的定位等。 William 等[ 3] 希望研究腺苷酸 环化酶刺激性 G 蛋白 ( Gnas) 基因突变的可能结果, 该基 因 有 13 个 外 显 子 , 被 定 位 在 人 类 染 色 体 的 20q 。用包含小鼠 Gnas 基因外显子 1 部分序列 的片段为探针 , 从文库中筛选出包含 Gnas 其它外显 子的 克 隆 , 从 中 获 得 了 一 个 长 为 6 1 0 kb、 两 端为 BamH I 酶切位点的片 段, 该片段 包含翻 译起始 位点 AUG 上游 21 0 kb 到第 2 外显 子中部的核苷 酸序列。 将该片段克隆到 pBluescript II 上, 并以之为基础构建 敲除载体。用 N coI 和 N ru l 双酶切上述片段 , 将位于 AUG 附近和第 1 外显子之间500 bp的片段切除, 并插 入作为筛选重要标记的新霉素抗性基因 ( neoR ) , 从而 构建了用于实现 Gnas 基因敲除的载体。 2 12 发生同源重组的干细胞的筛选 筛选发生了同源重组的干细胞的方法主要有以下
摘 要 : 基因敲除技术是研究功能 基因作 用的重要 方法 , 是后 基因组时 代的重 要研究 内容 。 从 基因 敲除的 细胞 基
础、 基因敲除载体的构建及发生同源重组干细胞的筛选 、 基因敲除动物模型的建立 、 基因敲除与基因拯救 、 国内基因敲 除 技术的研究现状等方面概括了基因敲除技术的研究进展和该技术目前存在的主要问题 。 关键词 : 基因敲除 ; 功能基因 ; 动物模型 中图分类号 : R 587 Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 1672- 5425( 2006) 02- 0004- 03
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将雄性小鼠的雌激素受体基因敲除 , 以
研究雌激素受体基因对公畜繁殖性能的影响。结果表 明, 雌激素受体基因被敲除的雄性小鼠 ( ERKO) 在解 剖学上是正常的 , 但这样的雄性小鼠不育。成年 ER2 KO 公鼠附睾中的精子远少于正常公鼠 , 3~ 5 月龄时 部分 ERKO 公鼠精细管中有精子生成 , 但多数 ERKO 公鼠的精细管膨胀为空腔 , 腔内有一些组织紊乱的上 皮细胞。 10 月龄 ERKO 公鼠的精细管与野生型公鼠 的精细管无明显区别, 附睾尾精子生成以及存活的数 量也与野生型公鼠接近。 10 月龄以后, ERKO 公鼠精 囊腺、 凝集腺、 前列腺以及附睾在形态学上是正常的, 但精细管内精子的发生出 现紊乱和退化。血清中 T 含量有所升高 , 但 LH 和 FSH 水平与野生型公鼠无明
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基因敲除与基因拯救
Li 等[ 7] 将小鼠 ESC 中的卡巴 B 蛋白抑制因子的激
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酶 2 基因敲除, 获得了杂合的 IKK2 突变体( IKK2
), 杂
6 合体在各个方面都是正常的, 通过杂合个体之间的交 配, 研究者在很长时间内未能得到该位点纯合的个体 , 即 IKK -2 / - 个体。在杂合状态时 IKK2 的表达只是受到 了影响, 但依旧有表达, 而一旦纯合就意味着该基因的 表达完全被中断, 或者说即便有表达, 表达出的蛋白质 也不再是正常的 IKK 2 。随后的研究表明, IKK-2 / - 属致 死基因型, 该位点纯合的个体在胚胎发育的早期 ( 12 15 ~ 13 1 5 d) 死亡。原因是当无 IKK2 表达时, 胎儿产生肿 瘤坏死因子 A( Tumor necrosis factor2A , TNF2A) 引起早 期胎儿的肝细胞发生大量凋亡, 而在正常情况下, IKK2 可抑制 TNF2A引起的肝细胞凋亡。那么能否拯救这样 的纯合子个体呢? 通过 IKK
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胚胎干细胞 ( Embryonic st em cells, ESC) 是早期 胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系, 体外培养时保持了未分化状态 , 可以传代增殖 , 在发育 上类似于动物早期胚胎的内细胞团细胞 , 具有与早期 胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍 体核型两大特 点, 是研究哺乳动物个体发育、 胚胎分化以及性状遗传 机制的理想模型 [ 1] 。 ESC 是进行基因敲除研 究不可替代的 材料。目 前, 虽然体外培养乳腺细胞、 胎儿成纤维细胞等细胞类 型的技术都已相当成熟 , 对这些类型的细胞进行基因 组修饰也是完全可能的, 但 ESC 的另一特性是其它任 何类型的细 胞都不具 备的, 那就是当 将一定数 目的 ESC 注入囊胚期小鼠的囊 胚腔后这些细胞可以参与 包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成 , 在此基础 上, 通过检测和选配 , 筛选出基因组中正常基因被破坏
基金项目 : 湖北省教育厅青年基金资助课题 ( 2004D016) 收稿日期 : 2005- 09- 14
wenku.baidu.com三种。
作者简介 : 刘建忠 ( 1967 - ) , 男 , 陕西 吴 堡人 , 副教 授 , 博 士 , 主 要 研究 方 向 为动 物 生物 技 术 。 电 话 : 027286534651, E 2 mail: jzhli2 umail2003@ yahoo. com. cn 。