逆境生理

逆境生理

7.1 电导法测定植物细胞透性

原理

植物组织在受到各种不利的环境条件(如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染)危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加。组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导值的变化，可反映出质膜受伤害的程度，也可以反映植物组织抗逆性的强弱。

仪器及试剂

仪器 1. DDS—11型电导仪2. 真空泵3. 真空干燥器4. 水浴锅5. 打孔器； 6.剪刀7. 洗瓶8. 试管9. 移液管 10. 玻璃棒11. 滤纸12. 天平；试剂：无离子水

材料:所培养的材料。

步骤1.清洗器具：由于电导值变化非常灵敏，稍有杂质即产生很大误差。因此所用玻璃器具均需予先用热肥皂水洗，再用洗液洗涤，然后用自来水冲洗干净，再用无离子水冲四、五遍（最好容器口向下用水冲）。向洗净的试管中加入无离子水，用电导仪测定电导值，检查是否洗净。然后倒立在洁净的滤纸上干燥，或烘干。

2.处理材料:取一定叶位和叶龄的功能叶，先用无离子水冲洗，最后用洁净的滤纸擦去水分，每组用打孔器打成12个叶圆片，放入试管中，加10ml无离子水（设3-4个重复）。放于真空干燥器中，用真空泵抽气10min，以抽出细胞间隙空气。缓慢放入空气，水即渗入细胞间隙，叶片变成透明状，细胞内溶质易于渗出。取出试管，间隔几分钟振荡一次，在室温下保持30min。

3.用电导仪测定外渗液的电导值。测定之后，将试管放入沸水中10min以杀死组织。等冷至室温后，再次测定外渗液的电导值。

4.结果计算

L1：叶片煮沸前外渗液的电导值；

L2：叶片煮沸后外渗液的电导值；

C1：对照叶片杀死前外渗液的电导值； C2：对照叶片杀死后外渗液的电导值；

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T1：处理叶片杀死前外渗液的电导值， T2：处理叶片杀死后外溶液约电导值；

注意事项

1. 所用玻璃器皿一定要洗净。

2. 测电导时，烧杯外面要干燥。

7.2 植物组织中超氧物歧化酶活性的测定

超氧物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除生物体内具有强烈毒性的超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：

2 +2H+→ H2O2 + O2

反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

原理

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

考马斯亮兰G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm。在稀酸溶液中，当其与蛋白质的疏水区结合后变为青色，最大光吸收在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（1～100μg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。该反应迅速，形成的化合物稳定，而且很灵敏，可以测定微克级蛋白质含量。

仪器与用具

高速低温台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管或指形管数支。

试剂

0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；

130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称 1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；

750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存；

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100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml；

20μmol/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml避光保存(当天配制)。

考马斯亮兰G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置一个月。

方法

1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，转移到5ml离心管中，加缓冲液使终体积为5ml。于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。

2、显色反应取5ml试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。

混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。

表1 各溶液加入量

试剂（酶）用量(ml) 终浓度（比色时）

0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750μmol/L NBT溶液100μmol/L EDTA-Na2液20μmol/L核黄素

酶液

蒸馏水3

0.6

0.6

0.6

0.6

0.2

0.4

13mmol

75μmol

10μmol

2.0μmol

对照管加缓冲液代替酶液

总体积 6.0

3、蛋白浓度的测定吸取样品提取液（SOD粗提液）0.1ml，放入具塞刻度试管中（设2个重复，空白以0.1ml缓冲液代替），加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，封口，充分混合后放置20min，在595nm下比色，记录光密度值，计算蛋白浓度。

4、蛋白浓度的计算蛋白浓度＝单位：mg蛋白/g样重

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