轴突导向因子的研究进展

目的：观察局灶性脑梗死大鼠皮质轴突生长导向因子-1 ( netrin-1，Ntn1)和臂板蛋白3a( semaphorin-3a，sema3a)的表达及电针干预对其表达的影响。

探索Ntn1与sema3a在电针对脑梗后神经可塑性影响中的作用。

方法：将135只雄性Sprague-Dawle（SD）大鼠分为正常组(n=15)、模型组(n=60)及电针组(n=60)。

利用线栓法制作大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，并行longa评分。

2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色与苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色确定造模成功。

电针选穴“内关”( PC6)，“足三里”( ST36)，刺激参数为疏密波，频率80～100Hz，强度以保持针刺局部轻微颤抖为度，留针30 min。

电刺激在大鼠麻醉苏醒后90 min 进行。

分别在术后1d、3d、7d、14d时，对术后大鼠进行神经功能评分(modified neurologic severity scores，mNSS)，利用免疫组化检测缺血侧大脑脑皮质中Ntn1、sema3a、神经丝蛋白200( NF200)分布和表达，免疫印迹法检测缺血侧大脑皮质Ntn1 和sema3a 的蛋白表达。

结果：免疫组化结果显示在各个时相点大鼠脑皮质均表达Ntn1 和sema3a，主要集中在细胞质阳性表达。

Westernblot 检测结果显示，与正常组相比，模型组Ntn1 蛋白的表达水平在脑梗死后1d即开始明显上升(P＜0.01)，3d时呈上升趋势( P＜
0.01)，7d时达峰值(P＜0.01),14d时仍显著高于基础水平(P
＜0.01)，电针组与模型组相比，Ntn1 蛋白表达趋势相同，但表达量明显高于模型组，术后1d、3d、7d、14d时有统计学差异( P＜0.05，P＜0.01).与正常组相比，模型组sema3a蛋白的表达水平在术后1d即开始上升(P＜0.01),7d时达高峰(P＜0.01),14d时仍高于基础水平(P＜0.01)。

同时相点电针组与模型组相比sema3a 均呈现低表达，1d、3 d 和7d、14d时有统计学差异( P＜0.05，P＜0.01)，峰值同样在7 d 时出现。

Western blot 检测结果与免疫组化分析结果基本相符。

7d、14d时电针组与模型组相比mNSS评分存在统计学差异(P＜0.05),14 d 时电针组与模型组相比NF200 的表达量存在统计学差异(P＜0.05)。

结论局灶性脑梗死后大鼠皮质Ntn1 与sema3a 表达明显上调，给予电针干预后可提高Ntn1 的表达并抑制sema3a 的表达，促进轴突的再生与修复，这可能是电针促进脑梗死后神经功能恢复的机制之一。

关键词：脑缺血再灌注; 电针; 轴突生长导向因子-1; 臂板蛋白3a
Abstract Objective To observe the expression of netrin-1 ( Ntn1) and semaphorin-3a (sema3a) in the cortex of rats after middle cerebral occlusion (MCAO)，and determine the effect of electro-acupuncture ( EA) intervention on their expression，so as to explore the roles of Ntn1 and sema3a in neural plasticity after cerebral infarction．
Methods A total of 135 male Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into control group ( n = 15) ，model group ( n = 60) and EA group ( n = 60，in the acupuncture points PC6 and ST36，80 to 100 Hz，1 to 3 mA，1 to 3 V，for 30 min，performed in 90 min after anesthesia recovery) ，and further assigned into 4 time point，that is，in 1d，3d，7d and 14 d after model establishment．Modified modified neurologic severity scores ( mNSS) were carried out to evaluate neurologic injury at every time point．Immunohistochemical assay was used to detect the expression and distribution of Ntn1，sema3a and NF200 in the cortical ischemic region．Western blotting was employed to detect the expression of Ntn1 and sema3a in the affected cortex．Results Immunohistochemical results showed that the rat brain cortex expressed Ntn1 and sema3a at every time point，and they mainly located in the cytoplasm．Western blotting indicated that the model group had higher expression of Ntn1 at 1 d ( P＜0. 01)，kept in elevation at 3 d ( P ＜0. 01) ，reached peak at 7 d ( P ＜0. 01) ，and maintained still higher at at 14 d than normal levels ( P＜0. 01).Compared with the control group，the expression of Ntn1 in EA group had the same trend，but the expression level was significantly higher than the model group,with significant differences in 1d，3d，7d and 14 d ( P＜0. 05，P＜0.
01) ．Compared with the control group，sema3a protein level in the model group began to rise in 1 d after model surgery ( P＜0.
01) ，increased and reached the peak in 7 d ( P＜0.01) ，and was still higher than the normal level in 14 d ( P＜0. 01) ．Compared to the model group，EA group presented low expression of sema3a at the same time point，with significant differences in 1d，3d，7d and 14 d ( P＜0. 05，P＜0. 01) ，and reached peak in 7d．The results of Western blotting and immunohistochemical assays were basically consistent．Compared with model group，the mNSS of EA group had significant differences in 7 and 14 d ( P＜0.
05) ．Significant difference was seen in the expression of NF200 between model group and EA group in 14 d ( P ＜0.
05) ．Conclusion Cerebral infarction significantly up-regulates the expression of Ntn1 and sema3a.EA intervention improves Ntn1 expression but suppresses sema3a,and promotes axon regeneration and repair，which may be one of the mechanisms that EA promotes the recovery of neurological function after cerebral infarction．
Key words：middle cerebral occlusion，electro-acupuncture，netrin-1，semaphorin-3a
伴随日益严重的人口老龄化，中国脑卒中发病率已居全球首位，其中缺血性脑卒中约占全部急性脑血管病的70%～80%，临床处理脑缺血性损伤的基本原则是尽早恢复血液再灌注，使缺血脑组织重新得到血氧的供应，提供组织代谢所必需的营养物质并清除代谢废物，减小脑缺血坏死及半暗带面积，然而缺血坏死后的血流恢复在可导致活性氧自由基等的进一步扩散从而加重组织损伤，这种损伤称为缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury）。

由于现代医学诊疗技术的快速提高，临床脑卒中患者的死亡率较之前已显著降低，然而其致残率却在存活者中高达80%以上，因此对于脑卒中患者的功能康复就显得尤为重要。

神经功能的康复主要来源于神经修复与功能区替代。

尽管近年来，对参与脑组织损伤后的各种病理现象及信号通路有了深入研究，包括凋亡[1]、自噬现象[2]、生长相关蛋白(GAP-43)[3]与脑源性神经营养因子（BDNF）等神经修复诱导因子、髓鞘相关抑制因子等多种多种抑制因子[4-5]，甚至可通过特定的抑制剂(如Y-27632等)阻断RhoA-Rho激酶通路，抑制轴突生长锥的塌陷，在一定程度上促进神经损伤后轴突的再生[6]，但由于这些信号通路存在于多种组织细胞，药物缺乏靶向性，故难以成为理想的治疗方案。

针灸作为中国传统医学重要的组成部分，其在神经功能康复中所起的作用受到全球的广泛关注与肯定[7]，但其作用机制确仍不清晰。

现已有大量临床究证实，针灸对脑梗后的功能恢复具有非常显著地作用，亦有大量的动物实验表明，电针可提高脑缺血半暗带脑红蛋白（Neuroglobin，NgB）表达，诱导脑缺血耐受，从而减轻脑缺血再灌注损伤[8]，对缺血再灌注引起的脑损伤具有良好的保护作用[9]，减少Nogo-A 和NgR 在脑组织内的表达，促进神经功能缺失症状的恢复［10］，促进缺血脑区微血管内皮细胞VEGFmRNA的表达并调控血管新生，帮助脑内微血管的功能重建[11]。

神经生长发育的基础是轴突的生长连接，轴突生长锥表达的结构与功能蛋白可使其正确识别靶分子后沿着特定的通道跨越一段距离，使神经元之间形成高度特异的功能回路，此过程可简称轴突引导。

目前已明确的轴突生长导向因子包括Slits家族、Netrins 家族、Ephrins 家族、
Semaphorins 家族、和RGM家族[12-13]，轴突导向因子对神经可塑性的影
响是当前的研究热点之一。

netrins 是一类分子结构上与组织基底膜的层粘连蛋白( laminin) 相关且进化上高度保守的可分泌蛋白，目前哺乳动物中已经鉴定出来的
netrins 分子包括3 种分泌型( Ntn1、3、4) 和两种跨模型( netrin-G1、G2) ，其中netrin-1（Ntn-1）是发现最早也是作用最强的［14］。

Ntn1
可通过与其受体结合介导轴突生长导向并可促进及调节轴突的生长与分
支的形成，同时可与其受体DCC 和Unc5B 结合而发挥促细胞存活作用，减轻脑缺血损害［15-16］。

脑梗后Ntn1在梗死灶周边出现高表达提示Ntn1 很可能参与脑缺血后的神经修复［17］。

Semaphorins是一类分泌或跨膜蛋白家族, 结构中均含有有Sema 结
构，不同的Semaphorin在轴突生长发育的不同时间空间上发挥作用，但
一般为高度特异的负调节作用，目前对sema3的研究较为深入。

semaphorin-3a（臂板蛋白，sema3a）是sema3的重要一员，通过与其受
体Neuropilin1( Nrp-1) 结合，特异性诱导轴突生长锥坍塌，抑制神经
突起形成分叉，最终阻碍轴突终末的形成，排斥性引导轴突延伸，从而
发挥其靶向导航作用，确保建立精确有效的神经连接［18]。

已有研究证实
sema3a 可在脑损伤后形成的胶质瘢痕及梗死灶周边中维持一定时间及
水平的高表达，提示sema3a 可能参与脑卒中后的神经修复过程并起到抑
制神经轴突再生的作用［19－ 21］。

在动物脊髓损伤模型中，阻断sema3a 与
Nrp-1 之间的结合，能够提高神经的再生修复能力［22］。

目前尚未见针灸对脑梗后功能恢复与sema3a及netri-1关联性研究报道，因此本实验拟采用大鼠MCAO模型结合电针治疗，观察电针对大鼠脑
梗后sema3a及netrin-1动态表达及轴突再生水平[23-24]和神经行为学评分
的影响，以期揭示电针的作用机理与轴突导向因子之间可能的密切关联，为临床神经损伤后治疗应用提供更多的佐证。

1.材料和方法
1.1主要实验仪器本实验操作部分在重庆医科大学中医药实验室与生科院
完成，所使用的主要仪器设备由上述实验室提供
仪器名称生产商
常规手术器械上海手术器械厂
－80℃冰箱海尔集团公司
移液器德国艾本德（Eppendorf）公司数码显微照相系统日本奥林巴斯（Olympus）公司精密电子天平瑞士梅特勒AB204
电泳仪美国伯乐（Bio-Rad）公司
石蜡切片机上海徕卡仪器有限公司
普通光学显微镜重庆光电仪器有限公司
烘箱上海福玛实验设备有限公司
高速冷冻离心机美国Beckman公司
脱色摇床北京六一仪器厂
1.2 主要材料及试剂
试剂名称生产商
兔抗大鼠Semaphorin-3a多克隆抗体北京博奥森技术有限公
兔抗大鼠Netrin-1多克隆抗体北京博奥森技术有限公司
小鼠抗大鼠NF-200单克隆抗体武汉博士德技术有限公司
SABC（小鼠工作液）免疫组化试剂盒武汉博士德技术有限公司
DAB 显色试剂盒武汉博士德技术有限公司
HRP 辣根酶标记山羊抗兔 IgG 北京中杉金桥公司
小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体美国BD公司
丙烯酰胺（Acr:Bis，30%，29:1）上海碧云天公司
过硫酸铵上海碧云天公司
聚丙烯酰胺上海碧云天公司
十二烷基硫酸钠（SDS）美国Amresco公司
Tris-甘氨酸缓冲液美国NOVON公司
Tris-HCl缓冲液（PH=8.8）上海碧云天公司
Tris-HCl缓冲液（PH=6.8）上海碧云天公司
细胞组织快速裂解液上海碧云天公司
蛋白酶抑制剂cocktail 美国Sigma公司
预染蛋白标记物美国NEB公司
BCA蛋白定量试剂盒上海碧云天公司
10×EDTA修复液武汉谷歌生物有限公司
过氧化氢国药集团化学试剂有限公司1.3.1 0.01M 磷酸盐缓冲盐（PBS）配制
取9克氯化钠、5.801克十二水磷酸氢二钠(Na
2HPO
4
·12H2O)、0.592克
二水磷酸二氢钠(NaH
2PO
4
·2H2O)，溶于950ml超纯水中，玻璃棒搅拌，等
待其完全溶解后再加超纯水至1000ml，测量PH值（7.2－7.4）。

1.3.2 4%多聚甲醛配置
将40克多聚甲醛溶于0.01M PBS 700mL中，60℃水浴，封口隔夜，最终完全溶解变澄清，然后再加0.01M PBS至1000mL，避光4℃冰箱保存。

1.3.3 Western Blot 操作相关试剂配制
（1）10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：100gSDS（称取时带口罩）溶于1L超纯水，玻璃棒搅拌，50℃水浴完全溶解后室温下密封保存。

（2）10%过硫酸胺（AP）：临用前配制即可，0.1g过硫酸胺加入1.5mlEP 管中，需用时加入1ml超纯水即可，也可以4℃下1周内密封保质。

（3）电泳缓冲液：400ml超纯水中加入94g甘氨酸，15.15g三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），5gSDS，完全溶解后，再用超纯水溶解定容至500ml，室温下保存。

使用前用超纯水稀释至10倍。

缓冲液在电泳过程中可维持合适的pH并且使溶液具有一定的导电性。

（4）电转移缓冲液：制作针对聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜转移缓冲液，200mL甲醇（提高蛋白转移效率）中溶解3.03gTris碱与14.4g甘氨酸，加超纯水定容到 1L，室温下密封保存。

（5）封闭液：首先将Tris 电泳缓冲盐溶液(10×TBS,pH7.5)稀释10倍，将5g 脱脂奶粉（20%）和 0.2mL Tween20（浓度0.8%，目的降低非特异
性吸附）加入20mL稀释后液体中，临用前配制。

（6）1M Tri-Hcl（pH=7.4）：400mL超纯水中加入60.58g Tris碱，溶解后，用 10 M HCl 调节PH至7.4，加超纯水定容至总量500mL，室温保存。

（7）10×Tris 缓冲盐溶液（TBS）：1 M Tris（pH7.4-7.6）5mL中加入44g氯化钠，加超纯水至500ml完全溶解。

使用前超纯水稀释至10倍，4℃下密封避光保存。

（8）TBST洗涤缓冲溶液：将0.2mLTween20加入100mL 1×TBS液中，混匀后4℃密封避光保存。

1.3.4 30%蔗糖溶液的配制
0.01M PBS（PH=7.4）200mL中加入120g蔗糖搅拌均匀，完全溶解后再
加0.01MPBS定容至400mL，4℃冰箱密封避光保存。

2.1线栓制备
截取直径0.23mm渔线4cm，将一端0.5mm涂抹指甲油使其直径达到
0.25mm，晾干，在光镜下观察呈表面光滑球形，于线端20mm 处做标记，
75%酒精浸泡消毒后置入肝素生理盐水中备用。

2.2 MCAO模型手术
线栓法制作大鼠MCAO模型是目前较为主流的脑梗模型，方便操作，耗费少，但与真正临床上的脑梗发作仍有机理上很大不同，临床脑梗多有基础性血管神经疾病，多为缓慢进展急性发作，而线栓法为异物引起的健康成年大鼠的急性异物血管梗塞。

但作为脑梗模型康复研究对象，两者仍有梗塞后病理变化及恢复期组织再生、功能恢复的相似性，故仍有很强的科研指导价值，参照Longa［25］及其它研究者[18]的经验方法，以线栓法制备大鼠大脑右侧中动脉缺血(middle cerebral occlusion，MCAO) 再灌注模型。

具体操作流程：取SPF级健康300±20gSD雄性大鼠，以10%水合氯醛全麻大鼠，麻醉剂量为3.3ml/100g（若麻醉效果不佳，应按总麻醉剂量的10%逐步增加），取仰卧位，鼠板固定，备皮，碘伏消毒，沿气管右侧剪开颈部皮肤，钝性分离鼓泡腺并将其上翻保护，依次分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA），颈外动脉（external carotid
artery，ECA），颈内动脉（internal carotid artery，ICA），结扎颈总动脉，血管钳夹住颈外动脉与颈内动脉，在颈总动脉分叉处剪开颈总动脉，插入栓子约2.0±0,.2cm(插入时若遇阻力，调整栓子角度重新进入，切勿反复用力强行插入，以免穿破血管，引起蛛网膜下腔出血)，必须越过右侧大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA），达到大脑前动脉（anterior cerebral artery，ACA)的前端，堵塞来自对侧前动脉血流，5号线结扎栓子，松开血管钳，复位鼓泡腺，缝合皮肤，1.5h后取出栓子，右侧再灌注。

模型组接受类似处理，但不剪开血管插入栓子。

2.3 神经行为学评分
造模后，部分大鼠出现因损伤右侧颈部交感神经可出现右侧霍纳征，及脑梗后不进食、腹胀等现象。

参考Longa[25]的5 分制神经功能评分标准，在大鼠术后清醒后对其进行评分: 0 分: 无神经功能缺失; 1 分: 不能完全伸展对侧前肢，提尾悬吊时对侧前肢屈曲; 2 分: 爬行时向对侧转圈，追尾; 3 分: 爬行时向对侧倾倒;4 分: 不能自主行走，意识障碍。

评分为1 ～ 3 分大鼠纳入实验，0 分和4 分者剔出。

2.4 模型分组及排除标准
大鼠随便分成3组，正常组15只，模型组60只，电针组60只。

模型组与电针组再分为4个时相点（1d、3d、7d、14d），每个时相点各15只。

整个实验过程中若大鼠出现以下任一情况则排除：①未达时相点已死亡；②HE染色示右侧大脑无明显缺血病理改变；③取材时发现蛛网膜下腔出血灶；大鼠实验中被排除后，随便选SPF级别300±20gSD雄性大鼠一只，重新手术补充。

2.5 大鼠神经功能检测
分别于术后第1d、3d、7d、14d天对MCAO大鼠进行改良神经功能评分( modified neurological severity scores，mNSS)［26］，包括运动、感觉、反射、平衡共4大部分外加肌张力检查，总分为0 ～ 18 分，分值越高，表明神经功能缺损越严重，正常大鼠为0 分。

1.5 脑组织取材
MCAO模型大鼠清醒后，完成神经行为学评分后，随便选取1只，进行TTC
染色。

将大鼠深麻醉断颈处死，快速断头取脑，置于玻璃皿中，-20℃冰箱保存。

术后分别于1d、3d、7d、14d，模型组与电针组每组取8只，将大鼠深麻醉，仰卧位，鼠板固定，剪开胸腔，分别用磷酸盐缓冲液( PBS，pH 值为7.25～7． 35)250 mL 和4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液( 4% PFA·PBS) 200 mL经右心耳进行内固定。

固定时，灌注液保持每分钟50ml的匀速灌注，防止血液凝固或组织受压变形。

30 min 后大鼠身体基本僵硬（可依靠尾巴是否僵硬判断），断头取脑，冠状面切取前囟前后2 mm部分放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h.另外每组7只深麻醉后，立即断头取脑，取新鲜脑组织，锡箔纸包裹后-80℃冷藏。

3.电针干预
电针前将大鼠麻醉，鼠板固定，应用“华佗牌”30 号1 寸毫针，穴位依据《大鼠穴位图谱的研制》[27]，选取“内关”( PC6) ，“足三里”
( ST36) ，采用上海医疗仪器厂G6805 电针仪，刺激参数为疏密波，频率80 ～ 100 Hz，强度以保持针刺局部轻微颤抖为度( 电流强度1～3 mA，电压1 ～3 V) ，留针30 min。

电针过程中若大鼠苏醒后挣扎，应酌情补充适量麻药，切勿单纯依靠鼠板固定。

首次电刺激在大鼠麻醉苏醒后90 min 进行。

电针结束后，大鼠休息30min，再进行神经功能评分及检测。

4.形态学检测
5.Western blotting半定量检测Sema3a与Ntn-1的蛋白表达水平
5.1蛋白提取与活性测定
(1)严格按照组织总蛋白的提取和浓度测定说明书操作，剥离缺血灶周边区域脑皮层，将其置于玻璃匀浆器中约100mg，加入RIPA蛋白裂解液（预先混有蛋白酶抑制剂cocktail，按1mL/100mg脑组织），冰上低温研钵匀浆然
后冰浴25分钟，4摄氏度下15000转/min后离心10min，紧接着取上清液，-80℃分装冻存，避免反复冻融使蛋白发生变性。

(2)蛋白活性测定：Semaphorin-3a与netrin-1活性测定是严格依据说明中酶活性底物比色法来检测的，将大鼠脑梗周边和正常组大鼠对应部位正常脑组织每个样本放入500μl组织裂解液中预先处理，10000转离心10min，取上清液，BCA法测蛋白浓度，室温下10min，120μl终止缓冲液完成。

(3)此步骤严格按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作测定组织蛋白浓度：1.按标准1体积BCA试剂B中加入50体积BCA试剂A(即1:50)稀释配制BCA工作液。

2.用RIPA细胞裂解液稀释标准白蛋白（5mg/ml）10倍至0.5mg/ml。

(4)蛋白标准品梯度浓度稀释为以下浓度后，分别加入相应各个孔中，具体数值如下表：
标准孔编号标准白蛋白(0.5mg/ml) RIPA裂解液终浓度（mg/ml）
1 0μl 20μl 0
2 1μl 19μl 0.025
3 2μl 18μl 0.05
4 4μl 16μl 0.1
5 8μl 12μl 0.2
6 12μl 8μl 0.3
7 16μl 4μl 0.4
8 20μl 0μl 0.5
（5）首先各测定孔分别加总体积为20μl液体（RIPA细胞裂解液14μl 与蛋白样品6μl），然后各孔分别加入DAB工作液200μl，37摄氏度孵育25分钟，紫外分光光度仪检测540nm波长吸光度值。

（6）首先根据相应波长的吸光度值和标准蛋白浓度数值描绘出标准曲线，再以标准曲线为基础计算出各蛋白样品的浓度，最终根据测出的蛋白样本浓度配平每个样本，使配平后浓度值一致均为 6μg/μl。

BDNF brain-derived neurotrophic factor脑源性神经营养
PBS phosphate-buffered saline磷酸缓冲盐溶液
Tris 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol 三羟甲基氨基
NF-200 neurofilament-200神经丝-200
SPF Specefic pathogen Free 无特定病原体
MCAO middle cerebral artery occlusion 大脑中动脉梗塞
CNS central nervous system 中枢神经系统
PFA paraformaldehyde 多聚甲醛
RhoA Ras homologous A Ras基因同源物A
TTc 2,3，5一triphenyl tetrazolium chloride 2，3，5．氯化三苯基四氮唑EA electro-acupuncture 电针
Sema3a semaphorin3a臂板蛋白
SABC Strept Avidin-Biotin Complex 链霉亲和素-生物素复合物
DAB 3，3’-diaminobenzidine增敏二氨基联苯胺
Nrp-1 Neuropilin-1 神经菌毛素
Nogo-A Neurite Outgrowth Inhibitor 轴索过度生长抑制因子-A
SD Sprague Dawley远交群大鼠
NGB Neuroglobin 脑红蛋白
4.1HE染色观察脑组织病理学变化
基本步骤：1.脱水透明；2、浸蜡包埋；3、切片与贴片；4、脱蜡染色：苏木精水溶液中染色，酸水及氨水中分色，流水冲洗，酒精脱水，酒精伊红染色；5、脱水透明；6、封固。

脑梗死灶及其周边组织由于细胞缺血死亡损伤，显示细胞核稀疏，脑组织着色变浅。

4.2 2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色
配置2%的TTC溶液（PBS配置）20ml，全程避光保存。

随便取一只MCAO 大鼠新鲜脑组织放入透明玻璃器皿中，-20℃中冻存20分钟，使大鼠脑组织硬化，以便切割，在玻璃器皿用刀片将脑组织以冠状面分割6份（厚度尽量相等），缓慢加入TTC溶液，覆盖脑组织，避免脑组织贴在玻璃器皿上面，（可在反应一段时间后，将脑组织反面，使其能充分反应）锡箔纸包裹，避光封存，放入37℃烤箱中反应15分钟（可在反应一段时间后，将脑组织反面，使其两面均能充分反应），取出，数码相机拍照（不开闪光）。

阳性：脑缺血灶呈现白色，脑组织表面覆盖一层白色为脑膜。

4.3 免疫组织化学法检测ntn-1、sema3a。

NF200的表达情况
(1)将制作好的石蜡切片置于65摄氏度烘箱中烘片2小时，脱蜡后PBS
冲洗三次，每次冲洗5分钟。

(2)将切片置于胃蛋白酶缓冲液中修复10分钟。

(3)自然冷却后PBS洗3次，5 min每次。

(4)阻断内源性过氧化物酶，把石蜡切片放入足量3%过氧化氢（H2O2）
溶液中，在室温下孵育10分钟。

(5)PBS冲洗3次，5 min每次，轻轻甩干，干净试纸吸附大鼠脑组织组
织周边多余水分，用5% BSA封闭电荷20 min。

(6)去除切片表面多余BSA液，用移液器给每张切片组织表面滴加50μl
稀释后的对应一抗覆盖组织，4摄氏度冰箱过夜。

(7)再次PBS冲洗3次，每次冲洗5 min。

(8)去除切片表面PBS液，移液器给每张切片组织表面加50μl-100μl
相应种属的二抗，覆盖组织，4℃孵育50min。

(9)PBS冲洗3次，每次冲洗5min。

(10)去除切片表面PBS液，移液器给每张切片组织表面滴加50-100μl
新鲜配制DAB溶液，光学显微镜下观察控制显色时间。

(11)显色完全后，立即用自来水冲洗，紧接着再苏木素复染，1%盐酸酒
精分化（1-2秒），再次自来水冲洗，氨水返蓝，再次自来水冲洗。

(12)石蜡切片经过梯度酒精（70-100%）脱水干燥10min一个梯度，二甲
苯透明，中性树胶封固。

（免疫组化实验时采用PBS代替特异性一抗以便对照抗体染色切片，其余操作步骤相同。

）
5.2 Western blotting 操作相关步骤
如下公式配制10%SDS-PAGE分离胶（10ml）：
溶液成分凝胶液中各成分所需体积
双蒸水 2.75ml
30%丙烯酰胺溶液 3.3ml
1.0mol/L Tris(pH 8.8) 3.75ml
10%SDS 0.1ml
10%过硫酸胺0.1ml
TEMED 0.001ml
如下公式配制SDS-PAGE5%浓缩胶（4 ml）：
溶液成分凝胶液中各成分所需体积
双蒸水 2.75ml
30% Arc-Bis 0.62ml
1.0mol/L Tris(pH 6.8) 0.5ml
10%SDS 0.04ml
10%过硫酸胺0.04ml
TEMED 0.004ml
（1）准备实验相关蛋白样品：取上述操作提取后细胞总蛋白 80μl，再加5×SDS 蛋白上样缓冲液 20μl，混匀后沸水中水浴5分钟，使蛋白变性，分装，-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。

（2）10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）的配置：事先用乙醇清洗好玻璃板，干燥安装。

分别配制5%浓缩胶与10%分离胶，配胶最后加TEMED并
立即充分混匀。

灌胶时预留出灌浓缩胶所需空间（否则达不到浓缩效果），先灌分离胶，留梳齿长加1cm空间给基层胶，然后1-2毫升无水乙醇封顶覆盖隔绝空气，室温下胶约需20至30分钟完成聚合。

去除表面无水乙醇后用双蒸水冲洗胶面数次次，吸水纸吸干胶面水分，静置3至5 分钟，晾干，然后灌注适量浓缩胶后插入梳子，静置，30~50分钟后胶充分聚合。

（3）上样、恒压电泳：拔下梳子后，用蒸馏水冲洗上样孔数次后将玻璃板固定于电泳装置中，灌注电泳缓冲液（同时注意检查是否漏液）；取60μg蛋白样品上样（上样时体积不宜过大，避免条带互相挤压走形和边缘效应），安排蛋白分子量标准物（Marker）10μl上样。

开始100v恒压（避免因电压不稳或高电压出现不规则蛋白迁移条带），待溴酚兰进入分离胶后，120 V电压恒压电泳，待溴酚兰达到凝胶底部时断开电源结束电泳（避免因电压不稳或高电压出现不规则蛋白迁移条带）。

（4）转膜：首先准备与胶大小相同的6层滤纸和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，PVDF膜要先在甲醇中浸泡25秒，然后和滤纸一同浸于足量未稀释转移缓冲液中，平衡约15min，取出凝胶，切下基层胶，剥离至电转移缓冲液中平衡约5 min，蒸馏水洗去胶上面的SDS等离子；在电转缓冲液中，按顺序自下而上分别铺，滤纸、凝胶、PVDF膜重叠，滤纸铺在电转装置的两层海绵之间，膜侧在正极，胶面在负极，各层之间避免有气泡产生，安装有冰盒转移液的电转移装置。

通电恒流转膜，电压120v，转膜时间为120min，期间注意更换转移曹中的冰盒。

（5）封闭聚偏二氟乙烯膜非特异结合位点：转膜终了，分别进行蛋白染色液，脱色液脱色，观察蛋白迁移情况。

转移结束，取下PVDF膜，置于50 ml封闭液(10％脱脂牛奶溶于TBST）中，摇床平缓摇动，室温封闭120分钟，封闭之后用TBST漂洗三次，每次5分钟左右。

（6）一抗孵育、洗膜：封闭结束后，一抗孵育，将PVDF膜置于配制好的一抗孵育液袋中，按适当比例添加稀释后一抗液体，4℃孵育过夜。

（小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体按1: 800用TBST稀释，兔抗大鼠sema3a多克隆抗体与兔抗大鼠netrin-1多克隆抗体按1: 100比例用TBST稀释）。

一抗孵育完毕后，弃除袋内废弃反应液，用TBST液体充分洗膜5次，每次10
分钟，置于TBST液摇床上充分洗膜约10分钟，洗脱PVDF膜非特异性结合的一抗。

（7）二抗孵育、洗膜：与对应特异性二抗（封闭液稀释，二抗均为1:4000比例，5%脱脂牛奶置于TBST中）一起室温孵育90min。

用TBST液体充分洗膜5次，每次10分钟，置于TBST液摇床上充分洗膜约10分钟，洗脱非特异结合的二抗。

（8）显色反应、曝光：酶促增强化学发光法（ECL）显色，缓慢平稳摇动，PVDF膜与化学发光显色底物反应，以免出现边缘效应，反应时间根据实际情况而异（基本为1min左右），暗室曝光，olimpus洗片，实验中取胶和膜注意带手套。

（9）扫描分析：胶片用x-扫描仪扫描后，用quantity-one（bio-rad公司）软件分析各条带灰度值，内参为β-actin，分析各组Sema3a与netrin-1表达量的变化。

6. 统计学分析
数据以均数±标准差（x ±s）表示，所有数据均经过正态分布检测，采用SPSS 17.0 统计软件，行单因素方差分析、F 检验。

若总体均数不等或不全相等时，进行LSD-t检验，p＜0.05时具有统计学差异。

7.结果
7.1神经功能评分
正常组无神经功能缺失，术后1、3 d 时电针组和模型组之间神经功能评分( mNSS 评分) 比较差异无统计学意义( P ＞0. 05) 。

7、14 d 时电针组和模型组的mNSS 评分差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。

见表1(Table 1)。

7.2 免疫组化检测各组Ntn1 与sema3a 表达
Ntn1 与sema3a 在正常组及脑梗后大鼠脑皮质均有阳性表达，表达主要集中于细胞质，为粗细不等的棕黄色颗粒。

与正常组相比，模型组Ntn1 在缺血1 d 后表达即增强( P ＜ 0. 05) ，3 d 时达到高峰( P ＜ 0.。