柑橘皮渣中黄酮类化合物的活性研究

Response of luciferase
siRNA干扰分析 干扰分析
提取用siRNA干扰 h的NMU2R细胞的蛋白，利用 干扰24 的 细胞的蛋白， 提取用 干扰 细胞的蛋白 Western blot实验分析干扰效率。 实验分析干扰效率。 实验分析干扰效率
100
Expression of NMU2R(% of control)
柑橘类黄酮化合物的荧光素酶响分析
12
10
Multiple of response
8
6
4
响应值倍数 大于2 大于
ts in in in tin xtrac geret p e ri d ar i n g obile l T an l Hes ml N /ml N / g g/m g/m 20ug 500u 100u 500u NM U
siRNA干扰对样品荧光素酶活性的影响 干扰对样品荧光素酶活性的影响
由图中NMU对照组可 对照组可 由图中 通过siRNA干扰， 干扰， 知，通过 干扰 干扰组的NMU2R表达 干扰组的 表达 明显下降。 明显下降。给细胞加药 后，相对于未干扰组， 相对于未干扰组， 干扰组的荧光素酶的响 应倍数明显下降。 应倍数明显下降。说明 荧光素酶给药响应与 NMU2R表达相关。 表达相关。 表达相关
不同浓度的橘皮提取物对NMU2R的激活效果 的激活效果 不同浓度的橘皮提取物对
10
8
Multiple of response
6
4
2
8.36 y = 9.229− x − 2.097 1+ exp( ) 0.273
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
①
0
Log10C
不同浓度的橙皮苷对NMU2R的激活效果 的激活效果 不同浓度的橙皮苷对
由于在细胞中影响荧光素酶响应信号通路的因素很 多，可能出现未通过NMU2R受体通路而是通过其 它方式导致报告基因仍然表达的现象，造成假阳性 。因此，我们进行了阴性对照实验与siRNA干扰实 验，检测了在细胞不能表达或者表达受到限制时， 荧光素酶的响应情况。 不能表达NMU2R的高通量筛选模型细胞株（阴性 细胞株）进行荧光素酶响应实验。实验显示，与 NMU对照组和空白对照组相比较，在单独给药和 与Forskolin叠加给药时，橙皮苷和川陈皮素组的荧 光素酶响应值都没有明显差别，见图7。这说明在 细胞没有表达NMU2R时，橙皮苷和川陈皮素不能 引起荧光素酶的响应。
80
60
40
20
0 NMU2R-1 NMU2R-2 C
由上图可知， 序列（ 由上图可知，NMU2R-1序列（487，GCGCAACTAC 序列 ， CCTTTCTTGTT）的干扰效率为 ）的干扰效率为47.6%，NMU2R-2序 ， 序 列（790，GCCCATGTGGATCTACAATTT）的干扰 ， ） 效率为42.9%；两个序列都能干扰 效率为 ；两个序列都能干扰NMU2R细胞中 细胞中 NMU2R的表达，但NMU2R-1序列的干扰效果优于 的表达， 的表达 序列的干扰效果优于 NMU2R-2序列。因此，以NMU2R细胞株作对照，收 序列。 细胞株作对照， 序列 因此， 细胞株作对照 集用NMU2R-1序列的 序列的siRNA干扰了 h的NMU2R细 干扰了24 的 集用 序列的 干扰了 细 接入96孔板 分别用500µg/ml橙皮苷、5µg/ml川 孔板， 橙皮苷、 胞，接入 孔板，分别用 橙皮苷 川 陈皮素和5µM NMU进行 进行NMU2R细胞株荧光素酶检测 陈皮素和 进行 细胞株荧光素酶检测 实验，结果如下。 实验，结果如下。
4.5 4.0
Multiple of response
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
y = 4.688 −
3.586 x − 2.289 1 + exp( ) 0.183
②
Log10C
不同浓度的川陈皮素对NMU2R的激活效果 的激活效果 不同浓度的川陈皮素对
4.0 3.5 3.0
NMU2R-1 C
Multiple of response
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
500ug/ml Hesperidin
5ug/ml Nobiletin
5uM NMU
Samples
结论
1、柑橘皮提取物（即柑橘类黄酮混合物）能有效激活 、柑橘皮提取物（即柑橘类黄酮混合物） NMU2R,说明混合物中有能激活 说明混合物中有能激活NMU2R的物质。 的物质。 说明混合物中有能激活 的物质 2、混合物中的两种单质 、混合物中的两种单质——橙皮苷和川陈皮素能单独激活 橙皮苷和川陈皮素能单独激活 NMU2R。 。 3、橙皮苷和川陈皮素的 活性非假阳性。 、橙皮苷和川陈皮素的NMU2R活性非假阳性。 活性非假阳性 4、柑橘皮提取混合物的效能、半效浓度和效价分别为 、柑橘皮提取混合物的效能、 9.229、125.147ug/ml和38.957ug/ml； 、 和 ； 橙皮苷的效能、半效浓度和效价分别为4.688、 橙皮苷的效能、半效浓度和效价分别为 、 194.536ug/ml和122.564ug/ml； 和 ； 川陈皮素的效能、半效浓度和效价分别为4.899、 川陈皮素的效能、半效浓度和效价分别为 、 2.382ug/ml和1.214ug/ml。 和 。
由关系式① 求出柑橘皮提取物、 由关系式①、②、 ③求出柑橘皮提取物、橙皮苷和川陈皮 素的效能（ ）、半数有效浓度 素的效能（Efficacy）、半数有效浓度 (EC50)及效价强度 ）、 及效价强度 ），见下表 看出， （Potency），见下表。通过表 看出，提取物的效能最高， ），见下表。通过表1看出 提取物的效能最高， 药物橙皮苷和川陈皮素产生的最大效应也都比较大， 药物橙皮苷和川陈皮素产生的最大效应也都比较大，且两 种药物之间差距不是很大， 种药物之间差距不是很大，而两种药物的效价与半效浓度 却有一定差距，橙皮苷的浓度明显高于川陈皮素， 却有一定差距，橙皮苷的浓度明显高于川陈皮素，即川陈 皮素效价强度较大。 皮素效价强度较大。
创新性
本课题不仅检测了黄酮类化合物中各单体对NMU2R的 的 本课题不仅检测了黄酮类化合物中各单体对 激活效应，还通过利用NMU2R的siRNA干扰分析及阴性对 激活效应，还通过利用 的 干扰分析及阴性对 照实验，排除了假阳性的干扰。 照实验，排除了假阳性的干扰。 本课题确定了有效成分的效能（药物能产生的最大效 本课题确定了有效成分的效能（ ）、半效浓度 半效浓度（ 应）、半效浓度（药物作用效效应达到最大效应一般时所需 要的剂量或浓度）与效价强度（ 要的剂量或浓度）与效价强度（药物产生一定效应所需的剂 量或浓度） 量或浓度） 。
柑橘皮渣中黄酮类化合物的 生物活性研究
报告人： 报告人： 王道庆 指导老师： 指导老师： 郑旭煦 教授 殷钟意 高级实验师 郭莉霞 老师 重庆工商大学 环境与生物工程学院 药物化学与化学生物学研究中心实验室
研究背景与意义
柑橘类黄酮是一系列具有显著生物活性 的黄酮类化合物所组成的混合物,它们具有良 的黄酮类化合物所组成的混合物 它们具有良 好的水溶性和显著的药理作用， 好的水溶性和显著的药理作用，如橙皮苷有 抗炎、抗氧化、保护心血管系统等作用， 抗炎、抗氧化、保护心血管系统等作用，柚 皮苷具有降血脂、抗癌等功效， 皮苷具有降血脂、抗癌等功效，川陈皮素能 够促进脂质代谢与血糖的代谢。 够促进脂质代谢与血糖的代谢。 近年来，随着柑橘种植面积不断扩大， 近年来，随着柑橘种植面积不断扩大， 我国西南地区已成为亚洲最大的橙汁加工基 柑橘被榨出汁后， 地。柑橘被榨出汁后，产生的果渣废弃物多 采用填埋方式处理，既造成环境污染， 采用填埋方式处理，既造成环境污染，又浪 费资源。因此， 费资源。因此，对柑橘皮渣中黄酮类化合物 的生物活性的研究既可指导对柑橘皮渣的合 理利用，大大提高经济价值， 理利用，大大提高经济价值，又可缓解橙汁 加工废弃物造成的环境污染。 加工废弃物造成的环境污染。这对柑橘类黄 酮的研究进展与环境保护都具有重大意义。 酮的研究进展与环境保护都具有重大意义。
drug Efficacy EC50（µg/ml） （ ） Potency（µg/ml） （ ）
Extract of citrus peel Hesperidin Nobiletin
9.229 4.688 4.899
125.147 194.536 2Leabharlann Baidu382
38.957 122.564 1.214
阴性细胞株荧光响应分析
阴性细胞株荧光响应分析
18000 16000 14000
Drug groups Drug+Forskolin groups
12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
Hesperidin
Nobiletin
NMU
Control groups
Samples
通过不能表达NMU2R 的高通量筛选模型细胞株 （阴性细胞株）进行荧光 素酶响应实验。我们发现 ，与NMU对照组和空白 对照组相比较，在单独给 药和与Forskolin叠加给药 时，橙皮苷和川陈皮素组 的荧光素酶响应值都没有 明显差别。这说明在细胞 没有表达NMU2R时，橙 皮苷和川陈皮素不能引起 荧光素酶的响应。
2
0
10
/ml E 00ug
5uM
Samples
效能、 效能、半数有效浓度及效价强度分析
为了求出柑橘皮提取物、橙皮苷和川陈皮素可产 生的最大效应——效能（Efficacy）、半数有效浓 度 (EC50)及药物激活效应（响应倍数）为2时的 效价强度（Potency），我们对不同浓度的柑橘 皮提取物、橙皮苷和川陈皮素的NMU2R活性进行 了检测，将药物浓度以10为底的对数（Log10C ）及荧光素酶响应倍数(Multiple of response)S曲 线拟合，并求出它们的曲线关系式 。
研究内容
1、柑橘皮提取物对NMU2R的激活效应； 、柑橘皮提取物对 的激活效应； 的激活效应 2、各种黄酮类化合物单体对NMU2R的激活效应； 、各种黄酮类化合物单体对 的激活效应； 的激活效应 3、通过阴性细胞株进行假阳性分析； 、通过阴性细胞株进行假阳性分析； 4、通过siRNA干扰 、通过 干扰NMU2R表达进行假阳性分析。 表达进行假阳性分析。 干扰 表达进行假阳性分析
5.0 4.5 4.0
Multiple of response
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
y = 4.899 −
4.002 x − 0.377 1+ 1 + exp( ) 0.303
③
Log10C
药物的效能、 药物的效能、半效浓度及效价强度
方法流程图
柑橘类黄酮混合物活性检测
各种柑橘类黄酮单体活性检测
阴性细胞株对照
siRNA干扰对照 干扰对照
柑橘类黄酮化合物的荧光素酶响分析
本文以荧光素酶响应倍数（药品-Forskolin叠加作用 组响应值除以Forskolin对照组响应值）大于2为活性 判断基准。对柑橘皮提取物及柑橘皮提取混合物中的 主要黄酮类化合物——橙皮苷、柚皮苷、橘皮素和川 陈皮素进行了NMU2R活性检测，并且与NMU2R的内 源配体NMU的活性进行比较，它们的荧光素酶活性 值最大值如下图所示。