基于自组装电化学免疫传感器对污泥中PCB77的检测

Vol.34高等学校化学学报No.52013年5月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1092~1098 doi:10.7503/cjcu20120869

基于自组装电化学免疫传感器

对污泥中PCB77的检测

张　岩2,庄惠生1,陈寒玉2

(1.上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240;2.河南城建学院市政与环境工程学院,平顶山467000)摘要　构建了一种基于L ⁃半胱氨酸㊁壳聚糖㊁戊二醛和纳米金层层自组装技术的新型无标记㊁高灵敏电流型免疫传感器,并用于检测3,3′,4,4′⁃四氯联苯(PCB77).利用示差脉冲法研究了修饰电极表面的电化学特性以及测试溶液的pH 值㊁孵育时间和温度对免疫传感器性能的影响.实验结果表明,该免疫传感器在含不同浓度PCB77的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH =7.4)中于35℃下孵育30min 后,在含有5mmol /L K 3Fe(CN)6/K 4Fe(CN)6(摩尔比1∶1)和0.1mol /L KCl 的PBS 溶液(pH =6.0)中测定,响应电流与PCB77浓度在0.1~160ng /mL 范围内呈良好的线性关系,R =0.9964,检出限为0.01ng /mL.该传感器制备简单㊁灵敏度高㊁稳定性好,可以重复使用.将其用于检测实际污泥样品中的PCB77,回收率为95%~112%.

关键词　层层自组装;无标记;电流型免疫传感器;纳米金;3,3′,4,4′⁃四氯联苯(PCB77)中图分类号　O657 文献标志码　A 收稿日期:2012⁃09⁃21.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:21177082)资助.

联系人简介:庄惠生,男,博士,教授,博士生导师,主要从事环境化学与生态毒理学研究.E⁃mail:huishengzhuang@ 多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)可以通过生产过程中的废物排放和使用过程中的泄漏㊁挥发及焚烧等途径排放到环境中而长期稳定存在,并参与地表循环,进而通过食物链累积在生物体和人体内[1].慢性低剂量的PCBs 暴露能够引起肝脏损害㊁生殖异常㊁免疫抑制㊁神经和内分泌系统失调㊁阻碍婴儿发育以及妨碍智力发育等[2~4].因此,PCBs 被‘持久性有机污染物斯德哥尔摩公约“列为首批需要控制的一类污染物.毒理学家研究[3,4]发现,某些类二噁英结构的非邻位取代共平面结构PCBs 具有远高于其它同系物的毒性,这类PCBs 虽然以超痕量存在,但可通过食物链浓缩放大,对人体产生巨大的危害.3,3′,4,4′⁃四氯联苯(IUPAC 编号为PCB77)是环境中含量较高的类二噁英类PCBs,其反应活性较高,致突变㊁致畸和致癌毒性大,对生态环境和人类健康影响最为显著[5,6].检测环境和食品中的PCB77含量对评估PCBs 的环境风险及人体暴露有重要意义.

目前,测定PCBs 的常用方法是气相色谱结合电子捕获检测或质谱法.由于环境中所含的PCBs 浓度在ng 或pg 级,致使测定不但需要复杂的样品前处理过程,而且要求有训练有素的操作人员,使其应用受到了限制.大量研究致力于发展成本低廉且简便快速的检测方法,以便及时准确地对其进行监测[7~10].其中,免疫分析法由于具有特异性高和操作简便快速㊁经济等特点已被广泛应用于环境污染物的测定.Fránek 等[11]采用竞争酶联免疫检测法测定共面PCBs,该方法对非邻位取代的共面PCBs 具有高灵敏性.Chiu 等[12]通过制备单克隆抗体对共面PCBs 进行检测,所制备的单克隆抗体对共面PCBs 具有良好的特异性.前文[13]采用具有特异识别功能的分子信标作为DNA 的荧光标记试剂,建立了用于检测环境中痕量PCB77的基于分子信标抗体包被免疫检测模式的实时荧光定量PCR 新方法,该方法适合于痕量的环境有机污染物的大批量检测.免疫传感器由于具有快速㊁准确㊁高灵敏度㊁操作简单㊁自动化程度高㊁微型集成化㊁便于野外或者现场检测及样品处理简单等优点,近年来在环境污染物检测中备受关注[14].本文利用L ⁃半胱氨酸(LC)的巯基在金电极表面易形成硫金键的特性,先在金电极表面修饰带正电荷的L ⁃半胱氨酸,再将壳聚糖(CS)通过戊二醛(GA)共价固定在电极表面,然后将纳米金(NG)通过

壳聚糖层固定在电极上用于固定PCB77抗体,由此制备PCB77免疫传感器.壳聚糖的生物相容性良好㊁成膜性优异㊁毒性低且化学和机械稳定性好,特别适合构建生物传感器[15,16].而且由于其表面有丰富的氨基,对纳米金有较高的亲和力.实验结果表明,纳米金用于固定PCB77抗体是一种既能增加抗体固载量,又能保持抗体活性的固定方法.

1　实验部分

1.1　试剂与仪器4,4′⁃二溴联苯(PBB15)㊁3,4⁃二氯联苯(PCB12)㊁4,4′⁃二氯联苯(PCB15)㊁3,4,4′⁃三氯联苯(PCB37)和PCB77(100μg /mL,百灵威化学试剂公司);卵清蛋白(OVA)㊁戊二醛和HAuCl 4㊃4H 2O (上海化学试剂有限公司);壳聚糖(M w =1.0×106,脱乙酰度为75%~85%,上海生化试剂公司);丁二酸酐㊁硝基苯㊁甘油㊁K 4Fe(CN)6和K 3Fe(CN)6(国药集团化学试剂有限公司);柠檬酸三钠(广东光华化学厂有限公司).所用试剂均为分析纯,未经纯化直接使用;实验用水为二次蒸馏水.H800型透射电子显微镜(TEM,日本日立公司);磁力加热搅拌器(上海南汇电讯器材厂);电子分析天平(日本岛津公司);PAR2273型电化学工作站(美国普林斯顿公司),三电极体系:直径3mm 的自制免疫电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极为对电极.本文中所有电位数值均相对于饱和甘汞电极.1.2　PCB77抗体的制备

PCB77抗体由本实验室自制[17].先通过Friedel⁃Crafts 酰基化反应在PCB77分子上引入羧基官能团,得到半抗原,再以牛血清蛋白(BSA)为载体蛋白,按照活化酯法合成免疫原PCB77⁃BSA,对健康的雄性新西兰大白兔进行颈部和背部点状注射免疫,经过7次加强免疫后,采用试管凝聚实验法和琼脂双向扩散法考察其抗血清效价.当试管凝聚实验效价达到1∶640~1∶1280,琼脂双扩散法效价达到1∶32~1∶64时,再加强免疫1次,5~7d 后进行颈动脉全采血法取血.离心分离出血清,通过DEAE⁃32纤维素离子交换层析精制纯化抗体.将纯化后的抗体冻干,小份分装于-20℃保存.1.3　纳米金的制备

参照文献[18]方法制备金纳米粒子(NG),平均粒径为16nm.

Fig.1　Preparation process of the immunoelectrode on the surface of gold electrode

a.Self⁃assembling LC;

b.adsorption of GA;

c.bonding CS;

d.formation of NG monolayer;

e.adsorption of anti⁃PCB77.

1.4　免疫传感器的制备如图1所示,将金电极(直径为2mm)置于Piranha 溶液[V (98%H 2SO 4)∶V (30%H 2O 2)=3∶1]中加热浸泡10min,用水冲洗干净,依次用1,0.5和0.3μm 的三氧化铝悬浮液打磨,用水冲洗后,依次在水㊁乙醇㊁水中超声清洗3min,然后在0.5mmol /L 的H 2SO 4中于-0.3~1.3V 范围内以100mV /s 3901　No.5　张　岩等:基于自组装电化学免疫传感器对污泥中PCB77的检测