第三章物理图谱

基因组学
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§3 Physical mapping
§3.2 限制酶作图
片段 0.2kb,0.5kb
双限制性酶切图解
限制酶作图的基本方法
结论
必然来自0.7kb的BamHI片段，其中有一个EcoRI的位点
1.0kb
这必然是一个不含EcoRI位点的BamHI片段，如果我们如下放置1.0kb的片段，就可以解释1.5kbEcoRI片段的出现
将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一 电场（单向电场，使电泳中受阻的DNA分子在电场 改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重 新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到 10Mb。
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§3 Physical mapping
§3.2 限制酶作图
垂直交变电场电泳
预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小
1) 根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的DNA
片段长段:
NotI 酶: GC/GGCCGC
48=74 536 bp=75 kb
I-SceI 酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT
418=90 000 000 bp=90 000 kb
2) 由于多细胞真核生物基因组DNA存在大量的甲基化位点,
高G/C比。
稀有切点限制酶分为两大类：
•识别具有7或8个核苷酸序列的酶；
•识别序列包含靶DNA稀少基序的酶。
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§3 Physical mapping
§3.2 限制酶作图
选用稀有切点限制酶的注意事项
识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序 时，片段长度小于预期；
识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因 组一般A/T比较高, 应选G/C 高比例限制酶, 如-GC GGCCGC-
(NotI)
限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种 序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组；
基因组DNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基 因组DNA甲基化比例很高, 但果蝇和酵母基因组无甲基化。
§3.4 序列标记位点作图
1）放射杂交
辐射杂种（radiation hybrid)：含有其他生物染色 体片段的啮齿类动物细胞。 辐射杂种群（radiation hybrid panel)：通过放射 杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群。 辐射杂种群分为两类： •全基因组辐射杂种群 •单染色体辐射杂种群
序列标记位点作图：通过PCR或分子杂交将特定 DNA顺序定位在基因组染色体区段中。
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§3 Physical mapping
§3.4 序列标记位点作图
STS作图的原理
两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的 距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远， 分离的几率越大。
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§3.4 序列标记位点作图
序列标记位点作图—大基因组物理图主流构建技术 限制性酶切作图和FISH的优缺点
限制性酶切作图快速、简便，能提供详细定位信息， 但不能用于大基因组。 FISH可以用于大基因组，但难于操作，数据积累慢， 一次实验定位的标记不超过3-4个。
如何提高荧光原位杂交的分辨率？
原位杂交的分辨率与染色体的制备有关：
中期染色体分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于 哪条染色体；
机械伸展的中期染色体分辨率200—300kb； 非中期染色体分辨率可达到25kb以下。
用特殊技术制备的纯化 DNA可以进行纤维-FISH，分辨率可
达到10kb以下。
§3 Physical mapping
§3.2限制酶作图 DNA分子限制性位点的直接检测—光学作图
光学作图：直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点。
•凝胶拉伸：将染色体DNA悬浮于融化的琼脂糖中，然后滴加到用限制 酶包被的显微载波片上，当凝胶冷却时DNA分子呈伸展状态。然后用加 入氯化镁激活限制酶，切割DNA分子，同时加入荧光染料使DNA分子 染色，延伸的分子中的限制性酶切位点就逐渐形成缺口，可用高分辨率 的荧光显微镜检测到。 •分子梳理：将硅胶树脂包被的盖玻片浸入DNA溶液中，保留5分钟，使 DNA分子的末端黏附于盖玻片上，然后以0.3mm/s的速度移动玻片，使 DNA分子整齐排列在盖玻片表面，然后再加入限制性酶和荧光染料，就 可以在荧光显微镜下检测到酶切的缺口。
为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探 针至少40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技 术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。
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杂 交 探 针 非 特 异 位 点 的 封 闭
§3 Physical mapping
§3.3 荧光原位杂交
第三章 物理图绘制
§3.1 概述 §3.2 限制性作图 §3.3 荧光原位杂交 §3.4 序列标记位点作图 §3.5 克隆作图 §3.6 遗传图与物理图的整合
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§3 Physical mapping
§3.1 概述
为什么要进行物理作图？
•遗传学图谱分辨率有限 遗传学图的分辨率依赖于 得到的交换的数目。对于 人类与大多数真核生物来 说，巨大数量的后代不易 获得。 •遗传学图谱精确度有限
垂直交变电场 (OFAGE)，有2对电极， 分别位于凝胶对角线的 两端，2对电极轮流接 通电场，产生一个交替 的方向不同的电场， DNA分子在凝胶中不断 改变迁移方向。交变电 场电泳主要用于相对分 子量较大的DNA分子的 分离。
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大 肠 杆 菌 基 因 组 物 理 图
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§3.3 荧光原位杂交
原位杂交的操作
染色体分裂细胞 甲酰胺处理
加入探针
染色体变性
检测信号
早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同 时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。
20世纪80年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。
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耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans) 基因组NheI酶切图
§3 Physical mapping
§3.3 荧光原位杂交
荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）
指在染色体上进行DNA杂交，以便识别荧光标记探针在染色体 上位置的方法。
1.2kb,2.0kb
这必然也是不含EcoRI位点的BamHI片段，它们必须位于3.4kb的EcoRI片段中。这样就有两种可能：
BamHI亚适条件
BamHI部分限制性酶切的预测 如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括1.2+0.7=1.9kb的片段 如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括2.0+0.7=2.7kb的片段
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§3 Physical mapping §3.2 限制酶作图
限制性作图
定义：将限制性酶切位点标定在DNA分子的 相对位置。
局限性：只能应用于相对较小的DNA分子。
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§3.2 限制酶作图
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§3.4 序列标记位点作图
序列标记位点（Sequence tagged site, STS） :指一 段短的DNA序列,通常长度在100-500bp,易于识别, 在待研究的染色体或基因组中仅存有1个拷贝。因 此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两 个片段彼此重叠。
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§3.2 限制酶作图
稀有切点限制酶在物理作图中的应用
低等生物基因组物理作图 大分子DNA克隆片段的物理作图
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§3.2 限制酶作图 选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA
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结论：图谱II是基正因确组的学
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§3.2 限制酶作图
限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增 加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重 叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作 图更适合于小分子。 实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用识别6 个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。
作图文库
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物理作图
物理图谱
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§3.1 概述
物理作图的主要方法
限制性作图（restriction mapping) 荧光原位杂交（fluorescent hybridization,FISH) 序列标签位点（STS )作图 （ sequence tagged sites mapping)
酿酒酵母chr3遗传图与物理图的比较
ຫໍສະໝຸດ Baidu
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§3.1 概述
结构基因组学的发展：
遗传作图
物理作图
基因组测序
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§3.1 概述
物理作图的主要环节
大分子DNA的提取
大片段DNA的克隆
染色体 DNA
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§3.2 限制酶作图
大于50kb的基因组能否用限制性作图？
答案是肯定的。通过选择靶DNA分子中的稀有酶切位点
酶可以克服限制性酶切作图的局限性。
稀有切点内切酶: 在基因组DNA顺序中只有很少可识别
序列的限制酶, 一般识别位点在6-8碱基对之间, 并含有
STS需要具备的两个条件： 1）在染色体上的位置独一无二； 2 ）序列已知，方便PCR检测。
寻找STS的方法： 1）表达序列标签（expressed sequence tag, ETS)： 来源于cDNA克隆的小段序列。EST来自单拷贝的基因时可作为 STS； 2）SSLP 具有多态性且通过连锁分析进行定位的SSLP很有价值， 可以建立遗传图与物理图之间的联系； 3）随机基因组顺序。可通过对克隆的基因组DNA随机测序获 得，或者从数据库中寻找。
识别CG序列的稀有酶切点限制酶实际产生的DNA片段比预期
大得多.如NotI酶切人类基因组DNA产生的片段常在200 kb以
上，平均长度达到1Mb。
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§3.2 限制酶作图
大片段DNA的分离技术——脉冲凝胶电泳
PFGE的基本原理
两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它 们之间的图距根据它们的分离频率来算。
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§3.4 序列标记位点作图
STS作图原理图示(1)
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§3.4 序列标记位点作图
STS作图原理图示(2)
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STS作图的DNA片段群 作图试剂（mapping reagent)：STS作图过程中用 到的可覆盖待研究的染色体或基因组的DNA片段群。
如何获得作图试剂？ 1）放射杂交 2）克隆文库
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限制性作图的基本原理
比较一种DNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。 首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNA片段的大小。 然后用第二种酶处理，获得第二组片段。 最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。 收集上述资料进行对比组装。 两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。 连续出现2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法。 切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。