新型核酸分子荧光探针——分子信标的研究进展
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的 ；２ 茎 干 区 （ ｔｍ） 两 段 长 度 为 ５ （） Ｓｅ ： ～８个 碱 基 的互 补 序列 ； ３ 荧 光基 团 ： 般 连接 在 ＭＢ的 ５一 ， 见 （） 一 端 常
求， 人们 通过 各种 分子工 程策 略 ， 发展 了许 多 敏锐性 更
高、 选择 性更优 的 ＭＢ 。 作 者在此 对 ＭＢ 的结 构 、 设计 原 理 、 力 学 研 究 、 热 选 择性 与 动 力 学 研 究 进 行 了 综 述 ， 对 非 典 型 ＭＢ 并
“Ｎ 。 ＿
ｏ
舯 ～
Ｄａ ｃ ｌ ｂ ｙ
基 金 项 目 ： 家 自然科 学基 金 资助 项 目（０ ７ ０ ６ ， 西 省 教 育厅 科 研 计 划 项 目（ １Ｋ０ ９ ） 西 安 医 学 院 自然 科 学 基 金 资 助 项 目 国 ５５３４） 陕 １Ｊ ６ ４ ，
（０ １ ＦＣ０２１ ）
收 稿 日期 ： ０ １ １ — ２ ２１— ２ ８
作 者 简 介 ： 丽 丽 （９ ３ ）女 ， 江 衢 州 人 ， 士 ， 师 ， 究方 向 ： 分 子 药 物 栽 体 材料 ，－ ｉ ｙ ｌｉ １ ＠ １３ ｃｒ。 余 １８一 ， 浙 博 讲 研 高 Ｅ ｍａ ：ｕｉ０ ８ ６ ．ｏ ｌ ｌ２ ｎ
示。
由态 、 与检 测序列 互补 形成 双螺旋 结构 ； ＭＢ有 ３ 而 种 可 能存在 的状 态 ： 与检 测 序 列 杂交 形 成 双 螺 旋结 构
（ ｈ ｓ ） 发夹 结 构 （ ｈ ｓ ） 随机 盘 绕 结 构 （ ｈ ｓ Ｐ ａｅ１ 、 Ｐ ａｅ２ 、 Ｐ ａｅ
３， 图 ３ 示。 ）如 所
子 相 互作 用发 生 结构 变化 产 生 不 同 强度 的 荧光 信 号 ， 有 高灵 敏 度 、 具 高选 择 性 、 于 活 体 检 测 等 优 点 。 对 分 子 信 标 的 结 适 构 、 计 原 理 、 力 学研 究 、 设 热 选择 性 与 动 力 学研 究进 行 了综 述 ， 对 非 典 型 分 子 信 标 （ ＮＡ ＭＢ ｓ － ） 行 了介 绍 。 并 Ｌ ＿ 、 Ｑ ＭＢ 进
吸收 的能量通 过发 射荧 光 释 放 ， 过程 即 为荧 光 共 振 此
一 一
Ｐ ａｅ １Ｂｏ ｎ ｒ ｅ ｈ ｓ ： ｕ ｄ ｔ ｔ ｇ ｔ ｏａ Ｐ ａ ｃ２ Ｃ ｏ ｅ ｈ ｓ ： ｌ ｓｄ Ｐ ａ ｅ３Ｒａ ｄ ｍ ０１ ｈ ｓ ： ｎ ｏ ｃｊ
图 ３ ＭＢ在 体 系 中的 ３种 不 同 状 态
Ｆｇ ３ Ｔ ｅｔｒｅｄｆｅｅ ｔｓａｅ ｆＭＢ ｉ ｈ ｓｓｅ ｉ． ｈ ｈ ｅ ｉｆｒｎ ｔｔｓｏ ｎ ｔｅ． ｔｍ ｙ
ＭＢ的选择 性取决 于完 全互补 的检测 序 列一 ＭＢ形
成 的双螺旋 结 构 的解 旋 温 度 （ ０ 与 １个 碱 基 错 配 的 Ｔ）
Ｌｏ ｐ ｏ
检测 序列一 ＭＢ形成 的双 螺旋 结 构 的 解旋 温度 （ 的 Ｔ ）
亿 亏 与 生 物 Ｚ 程 ２１，ｏ ２ Ｎ ． ０２ Ｉ９ ｏ４ Ｖ ．
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅｎ ｎ ｅ ｉｇ ｅ ｓｒ ｏ ｇｉｅ ｒ ｎ
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ２ ５ ２ ． ０ ２ ０ ． ０ ｏ ： ０ ３ ６ ／．ｓ ｎ １ ７ — ４ ５ ２ １ ． ４ ０ ２
余 丽 丽等 ： 型 核 酸 分 子 荧 光 探 针— — 分 子 信 标 的研 究进 展 ／ ｏ ２年 ■ ４啊 新 ２１
２ ＭＢ 的设 计 原 理
在 没有 检 测 序 列 时 ， ＭＢ构 成 一 个 茎 一 环 结 构 （ ｔｍ— ｏ ｐ ， Ｓ ｅ Ｌ ｏ ） 荧光 基 团和 猝 灭基 团彼此 紧邻 ， 荧光 基 团将 外界 给予 的大部 分 能 量 传递 给猝 灭 基 团 ， 灭 基 猝 团吸收能 量后 以热 的形 式 散 发 ； 部分 未 被 猝灭 基 团 少 能 量 传 递 （ ｌｏ ｅｃｎ ｅ ｒｓｎ ｎ ｅ ｅ ｅｇ ｒｎ ｆｒ Ｆ ｕ ｒｓｅ ｃ ｅｏ ａ ｃ ｎ ｒｙ ｔａ ｓｅ ， Ｆ Ｔ＿ ， ＲＥ ）４ 常将 此时 的结构 称为 发夹结 构 ， ］ 如图 ２ 所
差 异性 。热 力 学研 究 表 明 ， ＭＢ在 发夹 结 构 的 自由能
Ｓｅ ｔｍ
低 于在 随机 盘 绕结 构 的 自 由能［ ７
， 意 味着 ， 这 杂
交最 易发 生在 温度改 变引起 的双 螺旋 结构相 变 到发 夹 结构 过程 中 ， 未过 渡到 随机盘 绕结 构之 前 。Ｓ ｅ 螺 而 ｔｍ
图 ２ Ｍ Ｂ 的 设 计 原 理
‘
旋结 构越 长 ， 全配 对 的双 螺 旋 结 构 和含 错 配 碱 基 的 完
Ｆｉ ２ Ｔｈ ｅ ｉｎ ｉ ｃ ｐ ｅｏ Ｂ ｇ． ｅ ｄ ｓｇ ｐｒｎ ｉ ｌ ｆ Ｍ
双螺 旋结 构 的解 旋温 度差 别越 大 ， ＭＢ的结 构 越稳 定 、
多个领 域［ 。近年 来 ， １ ］ ＭＢ特 别是 基 于 Ｄ ＮＡ 结构 的
ＭＢ， 已成 为一种 重要 工 具 ， 于 核酸 的复 制 、 组 、 用 重 翻 译 和表 达 的 研究 。为 了满 足 后 基 因组 时代 的 发 展 需
识 别 区域 ， 可与待 测核 酸序列 互补 配对 ， 达到识 别 的 目
新 型 核 酸 分 子 荧 光 探 针
分 子 信 标 的研 究 进 展
余 丽丽 姚 ‘ ， 琳 杨黎 燕 李 仲谨 。 。 （． １ 西安 医学院 药学 院， 陕西 西安 ７ ０ ２ ；． １ ０ １ ２ 陕西科技 大学化 学与化 工 学院 ， 陕西 西安 ７ ０ ２ ） １ ０ １
摘 要 ： 子 信 标 是 基 于 荧光 共振 能 量 传 递 原 理 设 计 的 一 种 发 夹 型 寡 聚 核 酸 分 子 荧 光探 针 ， 够 与 待 测 核 酸序 列 分 分 能
代 初 至今 ， ＭＢ 已被 广 泛 地 应 用 于生 物 、 物 、 学 等 药 化
的概念 。ＭＢ是 一 种 单链 寡 核 苷 酸 探 针 ， 有 独 特 的 具 茎 环状 （ 也称 发夹 型 ） 构 ， 结构 一般 包括 ４个部 分 ： 结 其
（） １ 环状 区（ ｏ ｐ ： Ｌ ｏ ） 一段 长度 为 １ ～３ ５ Ｏ个 碱 基 的 目标
ｏ ｌ ｔｏ ・ 降到 ４ ￣３ ０Ｌ・ ｏ ・ ＿ Ｅ ， 图 ４所 Ｓ ０ ０ ｔ ｌ Ｓ 。 ３如 ｏ ８
不 。
Ｓ ｅ 序 列长度 缩短 ， 导致背 景 噪音 的增 大 和选 ｔｍ 会 择 性 的下 降 。通 常来 说 ， ｔｍ 序 列 长度 在 ５ ７个 碱 Ｓｅ ～
４ ＭＢ的选 择 性 与 动 力 学 研 究
相对 于线 性 ＤＮＡ／ ＮＡ探 针 ， Ｒ ＭＢ表 现 出较 优 的 选 择性 ， 得 益 于 ＭＢ的发 夹 结构 ， 这 此外 ， ＭＢ还 可 通
的能量 传递都 不 以光 的形 式 释 放 ， 是 通 过非 辐 射 途 而
径 —— 热 的形 式 释放 ， 效地 提高 了猝灭效 率 ， 有 降低 了
（ ＮＡ— 、 Ｑ－ ） Ｌ ＭＢ Ｓ ＭＢ 进行 了介 绍 。
１ ＭＢ的 结 构
１９ ９ ６年 ， ａ ｉ Ｋｒｍｅ Ｔｙｇ 和 ａ ｒ首 次 共 同 提 出 了 ＭＢ
ｃ ｎ ＭＢ 的理 论基础 。许 多分 子生 物学 和核酸 化学 合 ｏ， ） 成 的研 究突破 都得 益 于 ＭＢ 的发 展 ， ２ 从 Ｏ世 纪 ６ Ｏ年
关键词 ： 子信标 ； 分 荧光 探 针 ； 酸 核
中 图分 类 号 ： ２ Ｏ ６ Ｑ ５ ５
文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ：６ ２ ４ ５２ １ ） ４ ０ ５ ０ １ ７ —５ ２ （ ０ ２ ０ —０ ０ － ４
１５ ９ ２年 Ｃ ａｇ ｆ 发 现 了碱 基互 补配 对原 理 ， ９ ３ ｈ ｒａｆ １ ５ 年 Ｗａｓ ｎ和 Ｃ ｉ ｔｏ ｒ ｋ在 此 基 础 上 提 出 了 ＤＮＡ 双 螺 旋 ｃ 模型， 这两大 发现 既是 生 物 分 子识 别 史 上 最 重大 的发 现 ， 是核 酸分 子 荧光 探 针 分 子 信 标 （ ｌ ｕａ ｅ— 又 Ｍｏｅ ｌｒｂ ａ ｃ
背景 噪音 。
过 优化序 列 提 高 它 的 选择 性 ｌ 。热 力 学研 究 表 明 ， ＿ ８
通 过增加 Ｓ ｅ 的长度 和稳 定 性 可 以有 效地 提 高 选 择 ｔｍ
性， 而提 高选 择 性 的最 简 单 方 法 则 是 增 加 Ｓ ｅ 序 列 ｔｍ
中 Ｇ、 Ｃ的含量 。但 是 ， 着 ＭＢ中 Ｓ ｅ 螺旋 结 构 稳 随 ｔｍ
３ ＭＢ的 热 力 学研 究
大 部分情 况 下 ， ＭＢ与 目标 分 子 的杂 交 可 以用 热 力学 系统解 释 。一 个 简单 的开 ／ 关模 型 可 近 似 描述 反 应 的最 初 和最终 状 态 。该 模 型 可通 过 实 验 数据 支 持 ： 当 ＭＢ与 检测序 列 完全 互 补 时 ， 形成 的双 螺 旋结 构 解 旋 温度 （ ） ４ Ｏ Ｔ 为 ２℃ ； 当 检测 序 列 中有 １个 碱 基 错 而 配 时 ， 成 的双螺 旋 结 构解 旋 温度 （ 在 ２ ～ ３ 形 Ｔ ） ８ １℃ 之间 。该模 型描 述 了检测 序列 中 １ 碱基错 配对 检测 个 序列 与 ＭＢ形成 的双 螺旋 结构 的影响 ： 配碱 基位 错
和杂交 速 率 常 数 都 维 持 在 可 接 受 范 围。 因 此 ， 衡 平
Ｓｅ ｔｍ序 列 长度 缩 短 带 来 的 选 择 性 降 低 和 Ｓ ｅ 序 列 ｔｍ 长 度增 长带 来 的杂交 速 率 常数 降 低 这 二 者 的矛 盾 ， 是
研 究者 面临 的一个 挑 战 。其 中一 种策 略是使 用更 长 的 Ｓｅ ｔｍ序 列 （ ｔｍ 序列包 含 与 目标 序列 结合 的 Ｌ ｏ Ｓｅ ｏ ｐ序 列 部分 ） 该 方法可 以实 现杂 交 速 率 的 加快 ， 不 需 牺 ， 且
定 性 的提 高 ， 的 杂 交 速 率 会 有 所 减 慢 。线 性 Ｄ 它 ＮＡ 探 针长度 为 １ ～１ ７ ９个碱 基时 ， 的杂 交 速率 常 数 在 １ 它
ｘ １ Ｌ・ ｏ ・ － 左 右 ； 是 ＭＢ的 Ｓｅ 长度 从 ４ Ｏ ｏ Ｓ１ ｔ ｌ 但 ｔｍ 个 碱基 增加 到 ６ 碱基 时 ， 个 杂交 速 率 常数 从 ５ ０ ・ ０ ０Ｌ
什 么 ＭＢ 比线 性 ＤＮＡ／ ＮＡ 探 针 的选 择 性 更 强 。首 Ｒ
选择 性越优 。
在 检测序 列 时 ， ＭＢ的发夹 结 构打 开 ， 灭基 团与 猝 荧 光基 团有效 分 离 ， 光 得 以恢 复 ， ｏ ｐ段 与 检 测 序 荧 Ｌｏ 列 形成 比发 夹 结 构 中 的 Ｓ ｅ 双 螺 旋 结 构 更 长 、 稳 ｔｍ 更
定 的杂 交双 螺旋 结构 。 大 多 数 Ｍ Ｂ的 设 计 都 基 于 Ｆ Ｅ 该 情 况 下 大 量 Ｒ Ｔ，
的荧光基 团是 荧光 素 （ ｌｏ ｅｅｎ ；４ 猝 灭基 团 ： 接 Ｆ ｕ ｒｓｉ） （ ） 连
在 ＭＢ的 ３ 端 ， Ｌ 常见 的猝灭 基 团有 Ｄ ｂ ｙ 、 ＨＱ－ ａ ｃｌＢ １和
Ｂ ＨＱ－（ １ ， 于 以上 猝 灭基 团的猝 灭效 率 在 ８ ２ 图 ）基 ５
～
９ 之 间 。 ７
基 之 间 、 ｏ ｐ长 度在 １ ￣２ Ｌｏ ５ ５个 碱基之 间 ， 能使 选 择性
置与 Ｌ ｏ ｏ ｐ中心 区域 越 接近 ， Ｔ 的影 响越 大 ， ｍ 对 ｍ 丁 与
的差距 也越 大 ］ 。 ＭＢ和线 性 Ｄ ＮＡ／ ＲＮＡ 探 针 在 热 力 学 上 的研 究
不 仅 说 明 了 Ｔ 和 选 择 性 之 间 的关 系 ， 同时 也 解 释 了为
求， 人们 通过 各种 分子工 程策 略 ， 发展 了许 多 敏锐性 更
高、 选择 性更优 的 ＭＢ 。 作 者在此 对 ＭＢ 的结 构 、 设计 原 理 、 力 学 研 究 、 热 选 择性 与 动 力 学 研 究 进 行 了 综 述 ， 对 非 典 型 ＭＢ 并
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基 金 项 目 ： 家 自然科 学基 金 资助 项 目（０ ７ ０ ６ ， 西 省 教 育厅 科 研 计 划 项 目（ １Ｋ０ ９ ） 西 安 医 学 院 自然 科 学 基 金 资 助 项 目 国 ５５３４） 陕 １Ｊ ６ ４ ，
（０ １ ＦＣ０２１ ）
收 稿 日期 ： ０ １ １ — ２ ２１— ２ ８
作 者 简 介 ： 丽 丽 （９ ３ ）女 ， 江 衢 州 人 ， 士 ， 师 ， 究方 向 ： 分 子 药 物 栽 体 材料 ，－ ｉ ｙ ｌｉ １ ＠ １３ ｃｒ。 余 １８一 ， 浙 博 讲 研 高 Ｅ ｍａ ：ｕｉ０ ８ ６ ．ｏ ｌ ｌ２ ｎ
示。
由态 、 与检 测序列 互补 形成 双螺旋 结构 ； ＭＢ有 ３ 而 种 可 能存在 的状 态 ： 与检 测 序 列 杂交 形 成 双 螺 旋结 构
（ ｈ ｓ ） 发夹 结 构 （ ｈ ｓ ） 随机 盘 绕 结 构 （ ｈ ｓ Ｐ ａｅ１ 、 Ｐ ａｅ２ 、 Ｐ ａｅ
３， 图 ３ 示。 ）如 所
子 相 互作 用发 生 结构 变化 产 生 不 同 强度 的 荧光 信 号 ， 有 高灵 敏 度 、 具 高选 择 性 、 于 活 体 检 测 等 优 点 。 对 分 子 信 标 的 结 适 构 、 计 原 理 、 力 学研 究 、 设 热 选择 性 与 动 力 学研 究进 行 了综 述 ， 对 非 典 型 分 子 信 标 （ ＮＡ ＭＢ ｓ － ） 行 了介 绍 。 并 Ｌ ＿ 、 Ｑ ＭＢ 进
吸收 的能量通 过发 射荧 光 释 放 ， 过程 即 为荧 光 共 振 此
一 一
Ｐ ａｅ １Ｂｏ ｎ ｒ ｅ ｈ ｓ ： ｕ ｄ ｔ ｔ ｇ ｔ ｏａ Ｐ ａ ｃ２ Ｃ ｏ ｅ ｈ ｓ ： ｌ ｓｄ Ｐ ａ ｅ３Ｒａ ｄ ｍ ０１ ｈ ｓ ： ｎ ｏ ｃｊ
图 ３ ＭＢ在 体 系 中的 ３种 不 同 状 态
Ｆｇ ３ Ｔ ｅｔｒｅｄｆｅｅ ｔｓａｅ ｆＭＢ ｉ ｈ ｓｓｅ ｉ． ｈ ｈ ｅ ｉｆｒｎ ｔｔｓｏ ｎ ｔｅ． ｔｍ ｙ
ＭＢ的选择 性取决 于完 全互补 的检测 序 列一 ＭＢ形
成 的双螺旋 结 构 的解 旋 温 度 （ ０ 与 １个 碱 基 错 配 的 Ｔ）
Ｌｏ ｐ ｏ
检测 序列一 ＭＢ形成 的双 螺旋 结 构 的 解旋 温度 （ 的 Ｔ ）
亿 亏 与 生 物 Ｚ 程 ２１，ｏ ２ Ｎ ． ０２ Ｉ９ ｏ４ Ｖ ．
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅｎ ｎ ｅ ｉｇ ｅ ｓｒ ｏ ｇｉｅ ｒ ｎ
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ２ ５ ２ ． ０ ２ ０ ． ０ ｏ ： ０ ３ ６ ／．ｓ ｎ １ ７ — ４ ５ ２ １ ． ４ ０ ２
余 丽 丽等 ： 型 核 酸 分 子 荧 光 探 针— — 分 子 信 标 的研 究进 展 ／ ｏ ２年 ■ ４啊 新 ２１
２ ＭＢ 的设 计 原 理
在 没有 检 测 序 列 时 ， ＭＢ构 成 一 个 茎 一 环 结 构 （ ｔｍ— ｏ ｐ ， Ｓ ｅ Ｌ ｏ ） 荧光 基 团和 猝 灭基 团彼此 紧邻 ， 荧光 基 团将 外界 给予 的大部 分 能 量 传递 给猝 灭 基 团 ， 灭 基 猝 团吸收能 量后 以热 的形 式 散 发 ； 部分 未 被 猝灭 基 团 少 能 量 传 递 （ ｌｏ ｅｃｎ ｅ ｒｓｎ ｎ ｅ ｅ ｅｇ ｒｎ ｆｒ Ｆ ｕ ｒｓｅ ｃ ｅｏ ａ ｃ ｎ ｒｙ ｔａ ｓｅ ， Ｆ Ｔ＿ ， ＲＥ ）４ 常将 此时 的结构 称为 发夹结 构 ， ］ 如图 ２ 所
差 异性 。热 力 学研 究 表 明 ， ＭＢ在 发夹 结 构 的 自由能
Ｓｅ ｔｍ
低 于在 随机 盘 绕结 构 的 自 由能［ ７
， 意 味着 ， 这 杂
交最 易发 生在 温度改 变引起 的双 螺旋 结构相 变 到发 夹 结构 过程 中 ， 未过 渡到 随机盘 绕结 构之 前 。Ｓ ｅ 螺 而 ｔｍ
图 ２ Ｍ Ｂ 的 设 计 原 理
‘
旋结 构越 长 ， 全配 对 的双 螺 旋 结 构 和含 错 配 碱 基 的 完
Ｆｉ ２ Ｔｈ ｅ ｉｎ ｉ ｃ ｐ ｅｏ Ｂ ｇ． ｅ ｄ ｓｇ ｐｒｎ ｉ ｌ ｆ Ｍ
双螺 旋结 构 的解 旋温 度差 别越 大 ， ＭＢ的结 构 越稳 定 、
多个领 域［ 。近年 来 ， １ ］ ＭＢ特 别是 基 于 Ｄ ＮＡ 结构 的
ＭＢ， 已成 为一种 重要 工 具 ， 于 核酸 的复 制 、 组 、 用 重 翻 译 和表 达 的 研究 。为 了满 足 后 基 因组 时代 的 发 展 需
识 别 区域 ， 可与待 测核 酸序列 互补 配对 ， 达到识 别 的 目
新 型 核 酸 分 子 荧 光 探 针
分 子 信 标 的研 究 进 展
余 丽丽 姚 ‘ ， 琳 杨黎 燕 李 仲谨 。 。 （． １ 西安 医学院 药学 院， 陕西 西安 ７ ０ ２ ；． １ ０ １ ２ 陕西科技 大学化 学与化 工 学院 ， 陕西 西安 ７ ０ ２ ） １ ０ １
摘 要 ： 子 信 标 是 基 于 荧光 共振 能 量 传 递 原 理 设 计 的 一 种 发 夹 型 寡 聚 核 酸 分 子 荧 光探 针 ， 够 与 待 测 核 酸序 列 分 分 能
代 初 至今 ， ＭＢ 已被 广 泛 地 应 用 于生 物 、 物 、 学 等 药 化
的概念 。ＭＢ是 一 种 单链 寡 核 苷 酸 探 针 ， 有 独 特 的 具 茎 环状 （ 也称 发夹 型 ） 构 ， 结构 一般 包括 ４个部 分 ： 结 其
（） １ 环状 区（ ｏ ｐ ： Ｌ ｏ ） 一段 长度 为 １ ～３ ５ Ｏ个 碱 基 的 目标
ｏ ｌ ｔｏ ・ 降到 ４ ￣３ ０Ｌ・ ｏ ・ ＿ Ｅ ， 图 ４所 Ｓ ０ ０ ｔ ｌ Ｓ 。 ３如 ｏ ８
不 。
Ｓ ｅ 序 列长度 缩短 ， 导致背 景 噪音 的增 大 和选 ｔｍ 会 择 性 的下 降 。通 常来 说 ， ｔｍ 序 列 长度 在 ５ ７个 碱 Ｓｅ ～
４ ＭＢ的选 择 性 与 动 力 学 研 究
相对 于线 性 ＤＮＡ／ ＮＡ探 针 ， Ｒ ＭＢ表 现 出较 优 的 选 择性 ， 得 益 于 ＭＢ的发 夹 结构 ， 这 此外 ， ＭＢ还 可 通
的能量 传递都 不 以光 的形 式 释 放 ， 是 通 过非 辐 射 途 而
径 —— 热 的形 式 释放 ， 效地 提高 了猝灭效 率 ， 有 降低 了
（ ＮＡ— 、 Ｑ－ ） Ｌ ＭＢ Ｓ ＭＢ 进行 了介 绍 。
１ ＭＢ的 结 构
１９ ９ ６年 ， ａ ｉ Ｋｒｍｅ Ｔｙｇ 和 ａ ｒ首 次 共 同 提 出 了 ＭＢ
ｃ ｎ ＭＢ 的理 论基础 。许 多分 子生 物学 和核酸 化学 合 ｏ， ） 成 的研 究突破 都得 益 于 ＭＢ 的发 展 ， ２ 从 Ｏ世 纪 ６ Ｏ年
关键词 ： 子信标 ； 分 荧光 探 针 ； 酸 核
中 图分 类 号 ： ２ Ｏ ６ Ｑ ５ ５
文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ：６ ２ ４ ５２ １ ） ４ ０ ５ ０ １ ７ —５ ２ （ ０ ２ ０ —０ ０ － ４
１５ ９ ２年 Ｃ ａｇ ｆ 发 现 了碱 基互 补配 对原 理 ， ９ ３ ｈ ｒａｆ １ ５ 年 Ｗａｓ ｎ和 Ｃ ｉ ｔｏ ｒ ｋ在 此 基 础 上 提 出 了 ＤＮＡ 双 螺 旋 ｃ 模型， 这两大 发现 既是 生 物 分 子识 别 史 上 最 重大 的发 现 ， 是核 酸分 子 荧光 探 针 分 子 信 标 （ ｌ ｕａ ｅ— 又 Ｍｏｅ ｌｒｂ ａ ｃ
背景 噪音 。
过 优化序 列 提 高 它 的 选择 性 ｌ 。热 力 学研 究 表 明 ， ＿ ８
通 过增加 Ｓ ｅ 的长度 和稳 定 性 可 以有 效地 提 高 选 择 ｔｍ
性， 而提 高选 择 性 的最 简 单 方 法 则 是 增 加 Ｓ ｅ 序 列 ｔｍ
中 Ｇ、 Ｃ的含量 。但 是 ， 着 ＭＢ中 Ｓ ｅ 螺旋 结 构 稳 随 ｔｍ
３ ＭＢ的 热 力 学研 究
大 部分情 况 下 ， ＭＢ与 目标 分 子 的杂 交 可 以用 热 力学 系统解 释 。一 个 简单 的开 ／ 关模 型 可 近 似 描述 反 应 的最 初 和最终 状 态 。该 模 型 可通 过 实 验 数据 支 持 ： 当 ＭＢ与 检测序 列 完全 互 补 时 ， 形成 的双 螺 旋结 构 解 旋 温度 （ ） ４ Ｏ Ｔ 为 ２℃ ； 当 检测 序 列 中有 １个 碱 基 错 而 配 时 ， 成 的双螺 旋 结 构解 旋 温度 （ 在 ２ ～ ３ 形 Ｔ ） ８ １℃ 之间 。该模 型描 述 了检测 序列 中 １ 碱基错 配对 检测 个 序列 与 ＭＢ形成 的双 螺旋 结构 的影响 ： 配碱 基位 错
和杂交 速 率 常 数 都 维 持 在 可 接 受 范 围。 因 此 ， 衡 平
Ｓｅ ｔｍ序 列 长度 缩 短 带 来 的 选 择 性 降 低 和 Ｓ ｅ 序 列 ｔｍ 长 度增 长带 来 的杂交 速 率 常数 降 低 这 二 者 的矛 盾 ， 是
研 究者 面临 的一个 挑 战 。其 中一 种策 略是使 用更 长 的 Ｓｅ ｔｍ序 列 （ ｔｍ 序列包 含 与 目标 序列 结合 的 Ｌ ｏ Ｓｅ ｏ ｐ序 列 部分 ） 该 方法可 以实 现杂 交 速 率 的 加快 ， 不 需 牺 ， 且
定 性 的提 高 ， 的 杂 交 速 率 会 有 所 减 慢 。线 性 Ｄ 它 ＮＡ 探 针长度 为 １ ～１ ７ ９个碱 基时 ， 的杂 交 速率 常 数 在 １ 它
ｘ １ Ｌ・ ｏ ・ － 左 右 ； 是 ＭＢ的 Ｓｅ 长度 从 ４ Ｏ ｏ Ｓ１ ｔ ｌ 但 ｔｍ 个 碱基 增加 到 ６ 碱基 时 ， 个 杂交 速 率 常数 从 ５ ０ ・ ０ ０Ｌ
什 么 ＭＢ 比线 性 ＤＮＡ／ ＮＡ 探 针 的选 择 性 更 强 。首 Ｒ
选择 性越优 。
在 检测序 列 时 ， ＭＢ的发夹 结 构打 开 ， 灭基 团与 猝 荧 光基 团有效 分 离 ， 光 得 以恢 复 ， ｏ ｐ段 与 检 测 序 荧 Ｌｏ 列 形成 比发 夹 结 构 中 的 Ｓ ｅ 双 螺 旋 结 构 更 长 、 稳 ｔｍ 更
定 的杂 交双 螺旋 结构 。 大 多 数 Ｍ Ｂ的 设 计 都 基 于 Ｆ Ｅ 该 情 况 下 大 量 Ｒ Ｔ，
的荧光基 团是 荧光 素 （ ｌｏ ｅｅｎ ；４ 猝 灭基 团 ： 接 Ｆ ｕ ｒｓｉ） （ ） 连
在 ＭＢ的 ３ 端 ， Ｌ 常见 的猝灭 基 团有 Ｄ ｂ ｙ 、 ＨＱ－ ａ ｃｌＢ １和
Ｂ ＨＱ－（ １ ， 于 以上 猝 灭基 团的猝 灭效 率 在 ８ ２ 图 ）基 ５
～
９ 之 间 。 ７
基 之 间 、 ｏ ｐ长 度在 １ ￣２ Ｌｏ ５ ５个 碱基之 间 ， 能使 选 择性
置与 Ｌ ｏ ｏ ｐ中心 区域 越 接近 ， Ｔ 的影 响越 大 ， ｍ 对 ｍ 丁 与
的差距 也越 大 ］ 。 ＭＢ和线 性 Ｄ ＮＡ／ ＲＮＡ 探 针 在 热 力 学 上 的研 究
不 仅 说 明 了 Ｔ 和 选 择 性 之 间 的关 系 ， 同时 也 解 释 了为