分光光度计的使用 ppt课件

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吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
0
40
80 120 160
蛋白质浓度（μg/ml ）
蛋白质标准曲线（双缩脲法：λ＝540nm）
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722E分光光度计使用
基本操作：（示教）
通电→仪器自检（ BLA ） →预热20min →设定波长→方式设定（MOOD → T（或A） →仪器调“0.000”(将遮光杯）置入光路， 在T方式下按“%T”键， →仪器自动校正后显 示“0.000 →参比液调“0.000”A →样品测 定→读取“A”。
特点：灵敏、精确、快速和简便。 应用：生物化学微量物质定量分析测定研
究中广泛使用的方法之一，常用于糖，蛋白 质，核酸，酶等的快速定量检测。 光谱范围：200～1000nm 。
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分光光度法的概念
分 红外分光光度计:大于760 nm的红外光区
光
光
度
计 的
可见光分光光度计:400～760 nm的可见光区
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722E分光光度计使用
注意事项： 1、预热----保证仪器准确稳定； 2、比色皿的清洁----待测液润洗、冲洗； 3、比色皿配套----比色皿不能随意； 4、比色皿内盛液体量---- 2/3 ，有液体，应用擦镜纸拭干，以保证光 路通过时不受影响； 5、拿放比色皿----应持其“毛面”，杜绝接触光路通过的“光面”； 6、溶液浓度要适当：吸光度读数处于0.1～0.7范围内为宜，否则误差较 大，要适当调整浓度。 7、分光光度计连续使用一般不超过2h。
和光线波长的影响 C－溶液的浓度 L－溶液的厚度
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Lambert-Beer定律的应用
1、利用标准管计算测定物的含量
用一已知浓度标准溶液和一个未知浓 度的待测溶液同样处理显色，测定吸光度， 根据Lambert-Beer定律得：
A1=K1C1L1 A2=K2C2L2
因为 K1=K2 L1=L2
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实验操作
实验内容：CuSO4溶液标准曲线的绘制 操作步骤： 1、用30%CuSO4溶液配制10%、15%、20%、25%、30%
的CuSO4溶液各6ml,(Ｃ1.Ｖ1＝Ｃ2.Ｖ2 ） 2、以波长580nm，测定A值；(蒸馏水调零） 3、以浓度（C)为横坐标，以A值为纵坐标绘制曲线
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Lambert-Beer定律（光吸收定律）
Lambert定律：A＝K1L
Beer定律：A＝K2C
Lambert-Beer定律：当一束单色光垂直通过一均匀的溶液
时，溶液的吸光度A，与溶液的浓度C及溶液的厚度L成正比。即 A＝KCL
其中：A－吸光度 K－为消光常数，表示物质对光线吸收的能力，受物质种类
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主要内容
１、分光光度法的概念 ２、分光光度计的结构与原理 ３、分光光度计的使用 ４、实验操作（CuSO4溶液标准曲线的绘制）
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分光光度法的概念
分光光度法：是利用物质特有的吸收光谱， 进行物质鉴定及测定其含量的一种分析技术。 也称为吸收光谱法。是光谱分析技术中最常 见的一种，应用最多的是紫外及可见分光光 度法。
所以
C2= A2
A1
×C1
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Lambert-Beer定律的应用
2、利用标准曲线计算测定物含量
先配制一系列已知浓度的测定物溶液，按 要求方法处理显色，在最大吸收波长（λmax） 处读取各管的吸光度，以各管吸光度A为纵 坐标，对应浓度C为横坐标，作标准曲线。 以后进行测定时，待测样品以相同条件在 λmax处读取吸光度，从标准曲线上即可查得 该待样品的浓度。
分
类
紫外分光光度计: 200～400 nm的紫外光区
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722E可见分光光度计
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722E可见分光光度计
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分光光度计的基本结构
光源
单色 光器
吸收池
检测 系统
钨丝灯 氢灯 氘灯
棱镜 衍射光栅
玻璃比色杯 石英比色杯
硒光电池 光电管 光电倍增管
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分光光度计基本原理
当一束单色光透过溶液时
部分被吸收 Ia
部分被反射 Ir
I 部分被透过
入射光 I0 反射光 Ir
吸收光
Ia
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比色皿 吸收杯
出射光 I
9
I0
C
I
←L →
Ｉ/ I0表示光线透过溶液的程度,称为透光 度,用T表示；－IgT表示溶液对光线的吸收
程度，用吸光度（A）表示。即
A＝－IgT ＝－Ig
I I0