核酸疫苗研究进展

动物医学进展,2004,25(3):37240

P rogress in V eterinary M edicine

Ξ

核酸疫苗研究进展

宋勤叶1,2,杨汉春2

(1.河北工程学院农学校区,河北邯郸057150;2.中国农业大学动物医学院,北京100094)

中图分类号:S852.4 文献标识码:A文章编号:100725038(2004)0320037204

摘　要:核酸疫苗(DNA疫苗)是20世纪90年代诞生的一种新型疫苗,具有能够激发机体全面免疫反应、不散毒、便于储存和运输等优点。抗原递呈细胞在DNA疫苗诱导产生的CTL反应中起主导作用。DNA疫苗的运输载体(脂质体、减毒突变的胞内菌等)、佐剂(细胞因子等)以及疫苗接种方法和途径等因素可以提高和改变DNA疫苗的免疫效果与反应类型。DNA疫苗自诞生以来,其安全性一直是人们关心的问题,也是DNA疫苗得以日后应用于临床的关键。

关键词:DNA疫苗;免疫机制;免疫效果;安全性W o llf等(1990)首次发现将携带外源基因的质粒DNA注入小鼠体内后会引发免疫现象。随后,W illiam s 等(1991)和T ang等(1992)相继验证了W o llf的发现。U l m er等(1993)报道编码流感病毒核蛋白基因的质粒直接注入小鼠肌肉内后,能保护机体免受同源毒株的攻击。1994年5月世界卫生组织在日内瓦召开了核酸疫苗会议,大大推动了核酸疫苗的研究。

与传统的弱毒或灭活疫苗相比,DNA疫苗具有不散毒、不返强的优点。与亚单位疫苗相比,具有能长期激活机体全面免疫反应(细胞免疫反应和体液免疫反应)、制备工艺简单和费用低廉(不用纯化蛋白)的优点。另外,DNA疫苗还具有可以制成标记性疫苗,便于临床诊断监测;性质稳定,便于储存和运输;以及应用范围广,不仅可用于传染病和寄生虫病的免疫预防,而且还能够用于肿瘤、自身免疫、过敏反应等疾病的治疗等优点。本文对近年来关于DNA疫苗的免疫机制、构建、接种方法和途径、增强DNA疫苗免疫效果的方法以及安全性评价等方面的研究进展作以综述。

1　DNA疫苗的免疫机制

研究表明,DNA疫苗既可以激发机体的细胞免疫反应,又可以激发体液免疫反应。目前对DNA疫苗诱导免疫反应机制的了解可概括为如下几点。

1.1　DNA疫苗诱导产生的CTL反应机制

(1)肌肉注射DNA疫苗后,注射部位的肌细胞在诱发CTL反应中不起直接和主导作用。研究表明肌肉注射DNA疫苗后,外源蛋白可在肌细胞内大量表达,因此,推测肌细胞本身可以充当抗原递呈细胞(A PC),将所编码的外源抗原递呈给T细胞,并诱导T细胞活化。Yokoyam a等[1]和D avis等[2]的研究表明肌注DNA 疫苗后,肌细胞可被T细胞识别,给上述推测提供了一定证据。但是肌细胞能被T细胞识别,并不意味着可以诱导T细胞反应。因为活化T细胞至少需要诱导细胞表面存在两种信号分子,即与TCR结合的M HC I类分子——第一信号分子,以及与T细胞表面CD28或CT2 LA24结合的共刺激分子B7——第二信号分子。而肌细胞表面表达上述两种信号分子的水平非常低,所以,理论上肌细胞不具有抗原递呈能力。To rres等[3]在10 m in之内切除DNA疫苗免疫部位的肌肉组织,对诱导的抗体及CTL反应无影响,认为质粒转染注射部位的肌细胞在DNA介导的抗体反应及CTL反应中不起主导作用。

(2)A PC在DNA疫苗免疫所引起的CTL反应中起重要作用。A PC可能通过3条途径参与抗原递呈:肌肉内的A PC直接吞入质粒,合成抗原蛋白,加工后进入M HC2I类抗原递呈途径;质粒免疫机体后,随血流进入外周淋巴器官,转染那里的A PC;肌细胞内合成的抗原释放到细胞外,通过某种方式传递给A PC,而后进入M HC2I类分子的抗原递呈途径。Fu等[4]将稳定表达转染质粒外源基因的肌细胞移植入机体后,可以诱导产生特异抗体和CTL反应。据此推测抗原是由肌细胞释放的,然后再由A PC摄取、加工和呈递,认为A PC s在DNA免疫中起着关键作用。而W h itton等[5]的研究结果与上述不尽相同,W h itton等将L C M V(lym p hocytic cho ri m m en ingitis viru s)核蛋白基因N P与泛素(U)共价连接后构建pC M V2U2N P质粒,使细胞表达的N P 蛋白带有降解标签,并且该蛋白能够迅速被泛素2蛋白酶系统识别降解,而不能释放到细胞外。结果发现经肌肉接种该质粒的小鼠均产生了高水平的CTL反应,而pC M V2N P组的CTL反应水平较低。由此认为CTL反应是由A PC直接摄取DNA质粒后诱导产生的,而通过摄取可溶性蛋白对CTL产生所起的作用是次要的,甚至可以忽略不计。I w asak i等[6]及其他学者应用嵌合小鼠模型对CTL反应机制的研究,均表明CTL反应仅受髓源A PC s的M HC分子限制,可见在DNA疫苗激发的CTL反应中,A PC起着关键作用,而注射部位的肌细胞不可能起直接作用。

1.2　DNA疫苗诱导产生抗体反应的机制

Ξ收稿日期:2003209211

作者简介:宋勤叶(1968-),女,河北邯郸人,在读博士研究生,主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。

已知B细胞活化增殖、产生特异性抗体,需要分泌性或外源性抗原的刺激和CD4+T细胞的辅助。而DNA免疫不同于天然病毒的自然感染过程,其产生的抗原蛋白为非细胞病变性的,不会分泌或引起转染细胞裂解而释放到细胞外,并且很多编码蛋白也很少能够展示到转染细胞表面,但是已有许多研究证实,DNA免疫确实能够激发机体产生特异性抗体反应。为了探索此疑问,W h itton等[5]同样根据泛素能够在胞内快速降解抗原蛋白的原理,将泛素化的抗原免疫小鼠,发现血清特异性抗体为阴性。此结果表明完整抗原蛋白的展示和胞外释放,在诱发特异性抗体产生过程中起关键作用。

那么,质粒DNA转染的细胞是如何将其表达的抗原蛋白释放到细胞外的呢?D avis等[3]发现DNA疫苗首次免疫小鼠后,可引起轻微炎症,再次免疫后炎症显著。从炎症反应的程度、范围和肌纤维的破坏程度来看,炎症反应是由于CTL细胞对肌细胞的识别和杀伤引起的。故推测特异性抗体的产生可能与CTL介导的特异性杀伤溶解注射部位炎症细胞及死亡裂解的转染细胞释放的抗原有关。另外,有学者推测,DNA疫苗诱发的抗体反应可能还与巨噬细胞、树突状细胞等细胞直接摄取质粒DNA有关。

2　DNA疫苗的构建

DNA疫苗的构建是DNA研究的基础和重要环节。主要包括哺乳动物细胞真核表达载体的选择、外源抗原基因的选择与分析、抗原基因与表达载体的连接与鉴定几个方面。

2.1　载体的选择

用于构建DNA疫苗的载体及其组件,直接影响着外源抗原蛋白的表达量和机体的免疫反应状况。用于构建DNA疫苗的质粒载体有多种,但多以pU C或pBR322为基本骨架,如pC I、p SV2、pR SV、p c DNA3.0、p c DNA3.1、p c DNA4.0、V R1320、pB K、p GFP等。这些载体均具有增强子2启动子(C M V、R SV或SV40启动子)、载体的选择标记(如Am p r、Kan r)、翻译起始序列、转录终止序列和Po lyA尾等元件。一般C M V(巨细胞病毒)启动子的调节功能最好,应用也最多。有的载体中具有内含子序列,其能够明显提高外源基因的表达水平。

2.2　外源抗原基因的选择和分析

外源抗原基因是病原体保护性抗原的编码基因,能够诱发机体产生保护性免疫。用于构建DNA疫苗的外源抗原基因可以是单个基因、完整的一组基因、编码抗原决定簇的一段或数段核苷酸序列,它们可以来自同一病原体的不同基因,也可以来自不同病原体,由此可以将两个或多个抗原基因构建在同一表达载体上,形成多价或多联DNA疫苗,达到一种疫苗预防多个血清型 基因型或多个病原体的目的。

2.3　外源抗原基因与表达载体的连接及鉴定

外源抗原基因与表达载体的连接,即克隆进表达载体内时,必须考虑外源基因开放阅读框的完整性、方向、插入位置及表达基因m RNA起始部位的Kazaka序列等因素。若构建多价或多联DNA疫苗,还需考虑各编码基因间的连接方式以及各基因表达产物诱导机体免疫反应时的互作关系,以保证免疫效果。赵平等[7]构建的编码HBV包膜-核心蛋白融合基因DNA疫苗比单基因疫苗能够诱导小鼠更持久的细胞免疫应答,认为用此融合基因疫苗治疗慢性乙型肝炎效果更好。而H einen等[8]报道当用强毒攻击接种表达流感病毒M2eN P融合蛋白质粒的易感猪时,免疫猪却表现出较非免疫对照组更严重的临床症状和更高的死亡率。说明不同基因间的连接方式以及各基因表达产物间的关系,直接影响着DNA疫苗的免疫效果。

3　DNA疫苗的接种方法和途径

接种方法和途径影响着DNA疫苗的免疫保护效果和反应类型。目前DNA疫苗的接种方法有注射接种法、基因枪接种法、非注射接种法(口服、吸入、涂擦等)和无针头(B i o jecto r)接种法等。接种途径有肌肉、皮内、皮下、鼻腔、静脉、消化道、皮肤(涂擦)、腹腔等。其中肌肉注射接种法和基因枪接种法在研究中应用最多。3.1　注射接种法

在诸多注射方法中肌肉注射接种是应用最早、最常用的方法,免疫效果很好。多数DNA疫苗的研究都用该方法,注射部位一般为股四头肌(如小鼠)或颈部肌肉(如猪)。肌肉注射后,质粒DNA可以较长时间存在于注射部肌肉内,诱发强而持久的免疫反应。免疫反应类型以T h1型为主,即主要激活CD8+的CTL细胞、CD4+的T h1细胞以及产生以分泌IgG2a为主的B细胞。Fynan等(1993)比较了经肌肉、静脉、鼻腔、真皮、皮下和腹腔等不同途径接种DNA疫苗(甲型流感病毒HA基因)后的免疫效果,结果除腹腔注射外,都产生了一定保护作用,但以肌肉和静脉注射效果最好,肌肉摄入和表达DNA的能力比其它组织高100～1000倍。

3.2　基因枪接种法

指将含有保护性抗原基因的质粒DNA包裹在金或钨颗粒上,利用高压加速装置将颗粒直接射入上皮细胞内,从而提高了质粒DNA的转染效率,以至16ng的质粒DNA就足以激发机体免疫应答,而肌肉注射小鼠需要50～100Λg。该接种方法主要倾向于诱导T h2型反应,即主要激活CD4+TH2类细胞和分泌IgG1型抗体为主的B细胞。

3.3　皮肤浸润或涂擦接种法

皮肤是机体与外界环境直接接触的门户,表皮内含有递呈抗原功能最好的A PC之一——朗罕氏细胞(L C),因此,通过皮肤途径接种DNA疫苗,可能会激发机体产生良好的免疫应答。H eckert等[9]报道将共表达NDV2HN基因和I BDV2V P2,3,4基因的质粒与二甲基亚砜以1∶1混合后,涂于SPF鸡翅部皮肤,发现该二联DNA疫苗能够诱发局部(泪液)和全身免疫反应,抗体反应持续至接种后15周。说明DNA疫苗可以经

83动物医学进展　2004年　第25卷　第3期(总第131期)