凝结芽孢杆菌发酵条件的优化_高书锋
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湖南农业科学 2010， （23 ） ： 34~38
Hunan Agricultural Sciences
凝结芽孢杆菌发酵条件的优化
高书锋， 任
摘
杰， 张德元， 陈
薇， 许丽娟， 魏小武
（湖南省微生物研究所， 湖南 长沙 410009 ）
要： 对一株畜禽用凝结芽孢杆菌菌株进行了发酵条件的优化， 通过单因素实验对培养条件、 培养基成分进行了筛选， 通过正
ingredients of culture medium were screened through single factor experiment, and the ingredients of culture medium were optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal culture conditions were: temperature 35 ℃ , rotational speed 220 r/min, liquid volume 10% , inoculation amount 3 ％ , initial pH =7.0, fermentation time 42 h; the optimal ingredients of culture medium were: glucose 8 g/L, yeast extract 12.5 g/L, KH 2PO4 3.0 g/L, MnSO4 · H2O 0.18g/L, · 7H2O 0.125 g/L. Under the optimized fermentation conditions and in the optimized ingredients of culture medium, MgSO4 the living bacteria amount can reach 38×108 cfu/mL.
表 1 发酵培养基正交实验的因素和水平设计
设置水平 1 2 3 A 6.0 8.0 10.0 B 5.0 7.5 10.0 影响因素 C 0.75 1.5 3.0 D 0.09 0.18 0.37
（g/L ）
E 0.125 0.25 0.50
4 12.0 12.5 4.5 0.45 0.75 注：A 为葡萄糖；B 为酵母膏；C 为 KH2PO4；D 为 MnSO4 · H2O；E 为 MgSO4 · 7H2O。
2 2.1
结果与分析 培养条件优化
2.1.1 不同温度对凝结芽孢杆菌发酵水平的影响 由图1 可知：不同温度对凝结芽孢杆菌发酵水平有 一定影响， 发酵温度为 30℃和 35℃时， 发酵液的活 菌数较高， 分别为 7.8×108 cfu/mL 和 8.6×108 cfu/mL， 40℃和 45℃发酵水平较低， 分别为 3.7×108 cfu/mL 和 2.7×108 cfu/mL， 初步确定最佳发酵温度为 35℃。 2.1.2 不同转速对凝结芽孢杆菌发酵水平的影响 由图 2 可知：不同转速对凝结芽孢杆菌发酵水平 有一定影响， 其中转速为 220 r/min 时， 发酵液的 8 活菌数最高， 为 12.4 ×10 cfu/mL， 转速为 140、 180、
1.2
方
法
1.2.1 菌液制备 （1 ） 菌种活化： 将凝结芽孢杆菌 菌种活化后转接到斜面培养基， 35℃ 培养 24 h， 备
第 23 期
高书锋等： 凝结芽孢杆菌发酵条件的优化
35
用。 （2 ） 种子液制备： 取 3 环活化菌种， 接入装有 100 mL 种子培养基的 500 mL 三角瓶中， 35℃、 220 r/min 培养 24 h。 1.2.2 活菌计数方法 活菌总数测定： 采用梯度稀 释后， 倾注平板菌落计数法。 1.2.3 培养条件优化 （1 ） 培养温度选择 ： 按 1% 的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液分 别转接到装液量为 20%、 pH=7.0 的发酵培养基， 分 35、 40、 45℃摇床发酵，转速为 200 r/min， 别置 30、 培养 48 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定最 佳发酵温度。 （2 ） 培养转速选择： 按 1% 的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液分别转接到装液量为 20%、 pH=7.0 的发酵培养基， 分别置 140、 180、 220、 260 r/min 摇床发酵， 温度 35℃ ， 发酵 48 h， 分别对 发酵液活菌数进行测定， 确定最佳发酵转速。 （3 ） 装液量选择： 按 1%的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液分别转接到装液量分别为 5%、 10%、 15%、 20%，初始 pH=7.0 的发酵培养基， 置 35℃ 、 220 r/min 摇床发酵， 发酵 48 h， 分别对发 酵液活菌数进行测定， 确定最佳装液量。 （4 ） 接种量选择： 分别以 1%、 3%、 5%、 7%和 10% 的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液接 入初始装液量为 10%、 pH 值为 7.0 的发酵培养基， 220 r/min 摇床发酵， 发酵 48 h， 分别对发 置 35℃ 、 酵液活菌数进行测定， 确定最佳接种量。 （5 ） 初始 pH 值选择：分别以 3%的接种量将种 龄为 24h 的凝结芽孢杆菌种子液接入初始 pH 分 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0 和 8.5， 装液量为 别为 5.0、 10%的发酵培养基， 置 35℃、 220 r/min 摇床发酵， 发 酵 48 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定最佳 初始 pH。 （6 ） 发酵时间选择： 分别以 3%的接种量将种龄 为 24h 的 凝 结 芽 孢 杆 菌 种 子 液 接 入 初 始 pH 为 7.0、装液量为 10%的发酵培养基，置 35℃、 220 r/ min 摇床发酵， 发酵 18、 24、 30、 36、 42、 48 h 后， 分别 对发酵液活菌数进行测定， 确定最佳发酵时间。 1.2.4 培养基单因素筛选 （1 ） 碳源筛选： 以基础 发酵培养基中葡萄糖的碳含量计算碳浓度， 将基础 发酵培养基中的碳源分别用其他碳源替换， 接种量 为 3%，装液量为 10%，置 35℃、 220 r/min 摇床发 酵， 发酵 42 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定 最佳碳源。 （2 ） 氮源筛选： 以基础发酵培养基中蛋白胨的
收稿日期： 2010-09-10 基金项目： 长沙市科技攻关资金专项 （K1003312-21 ） 作者简介： 高书锋 （1978-） ， 男， 河南洛阳市人， 助理研究员，
主要从事畜禽用益生菌方面的研究工作。
1 1.1
材料与方法 材
菌
来自百度文库
料
种 凝结芽孢杆菌 （Bacillus coagulans ）
1.1.1
交实验对培养基组成进行了优化。结果表明， 该菌株的最佳发酵条件： 温度 35℃、 转速 220 r/min、 装液量 10%、 接种量 3%、 初始 pH=7.0、发酵时间 42 h；最佳培养基组成：葡萄糖 8.0 g/L ，酵母膏 12.5 g/L， KH2PO4 3.0 g/L， MnSO4 · H2O 0.18 g/L， MgSO4 · 7H2O 发酵液活菌数达 38×108 cfu/mL。 0.125 g/L。在此最佳发酵条件和培养基组成下，
氮含量计算氮浓度， 将基础发酵培养基中的氮源分 别用其他氮源替换， 接种量为 3%， 装液量为 10%， 置 35℃ 、 220 r/min 摇床发酵， 发酵 42 h， 分别对发 酵液活菌数进行测定， 确定最佳氮源。 （3 ） 磷源筛选： 以基础发酵培养基中磷酸盐的 磷含量计算磷浓度， 将基础发酵培养基中的磷源分 别用 KH2PO4、 1/2 KH2PO4+1/2 K2HPO4 和 K2HPO4 替 换， 接种量为 3% ， 装液量为 10% ， 置 35℃ 、 220 r/ min 摇床发酵， 发酵 42 h， 分别对发酵液活菌数进 行测定， 确定最佳磷源。 （4 ） 无机盐筛选： 去掉基础发酵培养基中的无 机盐， 添加 0.002 mol/L 的不同种类的无机盐， 以不 加任何无机盐的发酵培养基作为对照，接种量为 3% ， 装液量为 10% ， 置 35℃ 、 220 r/min 摇床发酵， 发酵 42 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定最 佳无机盐类。 1.2.5 正交实验 根据凝结芽孢子杆菌发酵条件 单因素优化实验结果， 选出最佳的碳源、 氮源、 磷源 （葡萄糖、 酵母膏和磷酸二氢钾） 及 2 种对发酵水平 影 响 较 大 的 无 机 盐 类 （MnSO4· H2O 和 MgSO4· 7H2O ） ， 设计五因素四水平正交试验， 选用 L16 （ 45 ） 正交表进行正交实验（表 1 ）。 并对结果进行直观分 析和方差分析， 优化培养基组成。
菌种， 由湖南省微生物研究所实验室筛选保藏。 1.1.2 培养基 斜面培养基： 蛋白胨 10 g/L， 酵母 浸出物 5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂 20 g/L， pH=7.0～ 7.2； 种子培养基： 蛋白胨 10 g/L， 酵母浸出物 5 g/L， 氯化钠 5 g/L，pH=7.0 ～7.2； 基础发酵培养基： 葡萄 糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L， KH2PO4 1.0 g/L、 MgSO4 · 7H2O 0.5 g/L， NaCl 5 g/L、蒸馏水 1 000 mL， pH 值 7.0～7.2。
Key words: fermentation conditions; orthogonal design; Bacillus coagulans; probiotics 近年研究表明， 益生菌可改善动物肠道菌群的 平衡， 增强动物机体免疫力， 提高动物消化功能， 促 进动物生长发育和提高动物生产性能等益生作用， 其作为绿色饲料添加剂取代抗生素已得到广泛应 用 。 凝结芽孢杆菌既产乳酸又产芽孢， 具有一般乳 酸菌维持肠道微生态平衡， 刺激免疫， 提高动物消
(Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, PRC)
Abstract: The fermentation conditions of Bacillus coagulans were op timized, in which the culture conditions and
关键词： 发酵条件； 正交设计； 凝结芽孢杆菌； 益生菌 中图分类号： Q939.97 文献标识码： A 文章编号： 1006-060X （2010 ） 23-0034-05
Optimization of Fermentation Conditions for Bacillus coagulans
GAO Shu-feng, REN Jie, ZHANG De-yuan, CHEN Wei, XU Li-juan, WEI Xiao-wu
[1]
是发酵生产微生态制剂的关键技术， 也是微生态制 剂发挥生物学作用的重要因素[5]。笔者实验室筛选 出一株畜禽用益生菌，经鉴定为凝结芽孢杆菌， 本 研究以提高活菌数为目标， 初步探讨凝结芽孢杆菌 摇瓶液体发酵条件， 优化发酵工艺， 为进一步的发 酵罐生产提供依据。
化功能等益生作用， 还具有芽孢菌抗胃酸、 抗胆碱、 [2] [3] 抗热和抗干燥等抗逆能力 。 李国建 研究证实生长 肥育猪饲料中添加凝结芽孢杆菌制剂可显著提高 猪的平均日增重， 降低饲料成本； Adami and Cavaz－ zoni[4]发现凝结芽孢杆菌对仔猪粪中的微生物区系 有明显的影响， 且这种益生菌有利于改善动物的生 产性能。 凝结芽孢杆菌突出的饲喂功能和良好的加 工性能， 使其必将成为饲料添加剂行业中不可替代 的重要成员。 影响益生菌效果的因素有： 菌种、 活菌 含量、 使用阶段、 制剂的稳定性等， 其中提高活菌数
Hunan Agricultural Sciences
凝结芽孢杆菌发酵条件的优化
高书锋， 任
摘
杰， 张德元， 陈
薇， 许丽娟， 魏小武
（湖南省微生物研究所， 湖南 长沙 410009 ）
要： 对一株畜禽用凝结芽孢杆菌菌株进行了发酵条件的优化， 通过单因素实验对培养条件、 培养基成分进行了筛选， 通过正
ingredients of culture medium were screened through single factor experiment, and the ingredients of culture medium were optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal culture conditions were: temperature 35 ℃ , rotational speed 220 r/min, liquid volume 10% , inoculation amount 3 ％ , initial pH =7.0, fermentation time 42 h; the optimal ingredients of culture medium were: glucose 8 g/L, yeast extract 12.5 g/L, KH 2PO4 3.0 g/L, MnSO4 · H2O 0.18g/L, · 7H2O 0.125 g/L. Under the optimized fermentation conditions and in the optimized ingredients of culture medium, MgSO4 the living bacteria amount can reach 38×108 cfu/mL.
表 1 发酵培养基正交实验的因素和水平设计
设置水平 1 2 3 A 6.0 8.0 10.0 B 5.0 7.5 10.0 影响因素 C 0.75 1.5 3.0 D 0.09 0.18 0.37
（g/L ）
E 0.125 0.25 0.50
4 12.0 12.5 4.5 0.45 0.75 注：A 为葡萄糖；B 为酵母膏；C 为 KH2PO4；D 为 MnSO4 · H2O；E 为 MgSO4 · 7H2O。
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结果与分析 培养条件优化
2.1.1 不同温度对凝结芽孢杆菌发酵水平的影响 由图1 可知：不同温度对凝结芽孢杆菌发酵水平有 一定影响， 发酵温度为 30℃和 35℃时， 发酵液的活 菌数较高， 分别为 7.8×108 cfu/mL 和 8.6×108 cfu/mL， 40℃和 45℃发酵水平较低， 分别为 3.7×108 cfu/mL 和 2.7×108 cfu/mL， 初步确定最佳发酵温度为 35℃。 2.1.2 不同转速对凝结芽孢杆菌发酵水平的影响 由图 2 可知：不同转速对凝结芽孢杆菌发酵水平 有一定影响， 其中转速为 220 r/min 时， 发酵液的 8 活菌数最高， 为 12.4 ×10 cfu/mL， 转速为 140、 180、
1.2
方
法
1.2.1 菌液制备 （1 ） 菌种活化： 将凝结芽孢杆菌 菌种活化后转接到斜面培养基， 35℃ 培养 24 h， 备
第 23 期
高书锋等： 凝结芽孢杆菌发酵条件的优化
35
用。 （2 ） 种子液制备： 取 3 环活化菌种， 接入装有 100 mL 种子培养基的 500 mL 三角瓶中， 35℃、 220 r/min 培养 24 h。 1.2.2 活菌计数方法 活菌总数测定： 采用梯度稀 释后， 倾注平板菌落计数法。 1.2.3 培养条件优化 （1 ） 培养温度选择 ： 按 1% 的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液分 别转接到装液量为 20%、 pH=7.0 的发酵培养基， 分 35、 40、 45℃摇床发酵，转速为 200 r/min， 别置 30、 培养 48 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定最 佳发酵温度。 （2 ） 培养转速选择： 按 1% 的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液分别转接到装液量为 20%、 pH=7.0 的发酵培养基， 分别置 140、 180、 220、 260 r/min 摇床发酵， 温度 35℃ ， 发酵 48 h， 分别对 发酵液活菌数进行测定， 确定最佳发酵转速。 （3 ） 装液量选择： 按 1%的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液分别转接到装液量分别为 5%、 10%、 15%、 20%，初始 pH=7.0 的发酵培养基， 置 35℃ 、 220 r/min 摇床发酵， 发酵 48 h， 分别对发 酵液活菌数进行测定， 确定最佳装液量。 （4 ） 接种量选择： 分别以 1%、 3%、 5%、 7%和 10% 的接种量将种龄为 24 h 的凝结芽孢杆菌种子液接 入初始装液量为 10%、 pH 值为 7.0 的发酵培养基， 220 r/min 摇床发酵， 发酵 48 h， 分别对发 置 35℃ 、 酵液活菌数进行测定， 确定最佳接种量。 （5 ） 初始 pH 值选择：分别以 3%的接种量将种 龄为 24h 的凝结芽孢杆菌种子液接入初始 pH 分 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0 和 8.5， 装液量为 别为 5.0、 10%的发酵培养基， 置 35℃、 220 r/min 摇床发酵， 发 酵 48 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定最佳 初始 pH。 （6 ） 发酵时间选择： 分别以 3%的接种量将种龄 为 24h 的 凝 结 芽 孢 杆 菌 种 子 液 接 入 初 始 pH 为 7.0、装液量为 10%的发酵培养基，置 35℃、 220 r/ min 摇床发酵， 发酵 18、 24、 30、 36、 42、 48 h 后， 分别 对发酵液活菌数进行测定， 确定最佳发酵时间。 1.2.4 培养基单因素筛选 （1 ） 碳源筛选： 以基础 发酵培养基中葡萄糖的碳含量计算碳浓度， 将基础 发酵培养基中的碳源分别用其他碳源替换， 接种量 为 3%，装液量为 10%，置 35℃、 220 r/min 摇床发 酵， 发酵 42 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定 最佳碳源。 （2 ） 氮源筛选： 以基础发酵培养基中蛋白胨的
收稿日期： 2010-09-10 基金项目： 长沙市科技攻关资金专项 （K1003312-21 ） 作者简介： 高书锋 （1978-） ， 男， 河南洛阳市人， 助理研究员，
主要从事畜禽用益生菌方面的研究工作。
1 1.1
材料与方法 材
菌
来自百度文库
料
种 凝结芽孢杆菌 （Bacillus coagulans ）
1.1.1
交实验对培养基组成进行了优化。结果表明， 该菌株的最佳发酵条件： 温度 35℃、 转速 220 r/min、 装液量 10%、 接种量 3%、 初始 pH=7.0、发酵时间 42 h；最佳培养基组成：葡萄糖 8.0 g/L ，酵母膏 12.5 g/L， KH2PO4 3.0 g/L， MnSO4 · H2O 0.18 g/L， MgSO4 · 7H2O 发酵液活菌数达 38×108 cfu/mL。 0.125 g/L。在此最佳发酵条件和培养基组成下，
氮含量计算氮浓度， 将基础发酵培养基中的氮源分 别用其他氮源替换， 接种量为 3%， 装液量为 10%， 置 35℃ 、 220 r/min 摇床发酵， 发酵 42 h， 分别对发 酵液活菌数进行测定， 确定最佳氮源。 （3 ） 磷源筛选： 以基础发酵培养基中磷酸盐的 磷含量计算磷浓度， 将基础发酵培养基中的磷源分 别用 KH2PO4、 1/2 KH2PO4+1/2 K2HPO4 和 K2HPO4 替 换， 接种量为 3% ， 装液量为 10% ， 置 35℃ 、 220 r/ min 摇床发酵， 发酵 42 h， 分别对发酵液活菌数进 行测定， 确定最佳磷源。 （4 ） 无机盐筛选： 去掉基础发酵培养基中的无 机盐， 添加 0.002 mol/L 的不同种类的无机盐， 以不 加任何无机盐的发酵培养基作为对照，接种量为 3% ， 装液量为 10% ， 置 35℃ 、 220 r/min 摇床发酵， 发酵 42 h， 分别对发酵液活菌数进行测定， 确定最 佳无机盐类。 1.2.5 正交实验 根据凝结芽孢子杆菌发酵条件 单因素优化实验结果， 选出最佳的碳源、 氮源、 磷源 （葡萄糖、 酵母膏和磷酸二氢钾） 及 2 种对发酵水平 影 响 较 大 的 无 机 盐 类 （MnSO4· H2O 和 MgSO4· 7H2O ） ， 设计五因素四水平正交试验， 选用 L16 （ 45 ） 正交表进行正交实验（表 1 ）。 并对结果进行直观分 析和方差分析， 优化培养基组成。
菌种， 由湖南省微生物研究所实验室筛选保藏。 1.1.2 培养基 斜面培养基： 蛋白胨 10 g/L， 酵母 浸出物 5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂 20 g/L， pH=7.0～ 7.2； 种子培养基： 蛋白胨 10 g/L， 酵母浸出物 5 g/L， 氯化钠 5 g/L，pH=7.0 ～7.2； 基础发酵培养基： 葡萄 糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L， KH2PO4 1.0 g/L、 MgSO4 · 7H2O 0.5 g/L， NaCl 5 g/L、蒸馏水 1 000 mL， pH 值 7.0～7.2。
Key words: fermentation conditions; orthogonal design; Bacillus coagulans; probiotics 近年研究表明， 益生菌可改善动物肠道菌群的 平衡， 增强动物机体免疫力， 提高动物消化功能， 促 进动物生长发育和提高动物生产性能等益生作用， 其作为绿色饲料添加剂取代抗生素已得到广泛应 用 。 凝结芽孢杆菌既产乳酸又产芽孢， 具有一般乳 酸菌维持肠道微生态平衡， 刺激免疫， 提高动物消
(Hunan Institute of Microbiology, Changsha 410009, PRC)
Abstract: The fermentation conditions of Bacillus coagulans were op timized, in which the culture conditions and
关键词： 发酵条件； 正交设计； 凝结芽孢杆菌； 益生菌 中图分类号： Q939.97 文献标识码： A 文章编号： 1006-060X （2010 ） 23-0034-05
Optimization of Fermentation Conditions for Bacillus coagulans
GAO Shu-feng, REN Jie, ZHANG De-yuan, CHEN Wei, XU Li-juan, WEI Xiao-wu
[1]
是发酵生产微生态制剂的关键技术， 也是微生态制 剂发挥生物学作用的重要因素[5]。笔者实验室筛选 出一株畜禽用益生菌，经鉴定为凝结芽孢杆菌， 本 研究以提高活菌数为目标， 初步探讨凝结芽孢杆菌 摇瓶液体发酵条件， 优化发酵工艺， 为进一步的发 酵罐生产提供依据。
化功能等益生作用， 还具有芽孢菌抗胃酸、 抗胆碱、 [2] [3] 抗热和抗干燥等抗逆能力 。 李国建 研究证实生长 肥育猪饲料中添加凝结芽孢杆菌制剂可显著提高 猪的平均日增重， 降低饲料成本； Adami and Cavaz－ zoni[4]发现凝结芽孢杆菌对仔猪粪中的微生物区系 有明显的影响， 且这种益生菌有利于改善动物的生 产性能。 凝结芽孢杆菌突出的饲喂功能和良好的加 工性能， 使其必将成为饲料添加剂行业中不可替代 的重要成员。 影响益生菌效果的因素有： 菌种、 活菌 含量、 使用阶段、 制剂的稳定性等， 其中提高活菌数