抗凋亡基因Survivin与结直肠癌关系的研究进展

抗凋亡基因Survivin与结直肠癌关系的
研究进展
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】Survivin基因作为目前所发现的最强的凋亡抑制基因，是当前研究的热点。

本文首先介绍了Survivin 的基因结构，对其生物学作用进行了研究；然后分析了Survivin基因与结直肠癌的发生发展之间的关系；最终提出Survivin靶向治疗结直肠癌的方法以及Survivin 与结直肠癌预后关系。

【关键词】Survivin；结直肠癌；剪切异构体；靶向治疗在欧美等发达国家与地区，大肠癌的发病率已跃至恶性肿瘤的第2～3位，在我国的大部分地区，其发病率也占据恶性肿瘤的第4～5位。

手术切除癌肿是目前大肠癌最主要的治疗手段，但随着分子生物学的发展，肿瘤的靶点治疗必将作为一种新的治疗方法运用到临床，从而提高病人生存率。

Survivin基因是目前所发现的最强的凋亡抑制基因，具有高度的组织分布特异性并且与肿瘤的发生发展密切相关。

因此，对Survivin基因进行相关性研究在结直肠癌的诊断、治疗和预后均有很大价值。

本文主要针对不同剪切异构体对癌的影响及
Survivin靶向治疗结直肠癌展开了文献调研工作。

1 Survivin基因结构与生物学作用
1.1 Survivin基因分子结构凋亡抑制蛋白家族（Inhibitor of Apoptosis Family of protein IAPs），包括NAIP，c-IAP-1，c-IAP-2，XIAP，BRUGUE，Livin和Survivin 7个成员。

其中，Survivin于1997年由Altier用效应细胞蛋白酶受体1(effector cell protease receptor 1，EPR-1) cDNA从人类基因库的杂交筛选中首先分离得到。

人类Survivin基因定位于染色体17q25，全长14.7 kb，其编码链有426个核苷酸开放阅读框架，与EPR-1互补，该基因编码产物是由142个氨基酸组成的蛋白，分子量为16.2 kD的蛋白质。

在结构上，Survivin与其他的IAPs区别主要表现在：(1) 哺乳动物的IAPs中往往含有重复2～3次的BIR (beaulovirus IAP repeat)单元，而Survivin是迄今发现的IAPs中唯一的含单个BIR单元的成分，这一序列是其凋亡抑制作用的基本要素。

3个氨基酸插入序列将Survivin分为两半羟基端以交织螺旋结构(coiled coil)代替环指结构，以区别于其他IAPs成员；(2) Survivin的BIR中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Pro33、Trp67和cys84，通过这些残基与caspase-3以及caspase-7结合抑制caspase的活性，可以阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡；(3) Survivin中还含有一个独特的由42个氨基酸严格排序形成的双螺旋区域，该区域可能与Survivin 的抗凋亡功能有关。

1.2 Survivin的剪切异构体Survivin基因含有4个外显子（E1、E2、E3和E4）、3个隐藏外显子（2α、2b和3b）以及3个内含子。

Survivin的mRNA前体经过不同的剪切，除产生Survivin外还会产生Survivin-ΔEx3、Survivin-2B、Survivin-3B、Survivin-2α4种剪切异构体，翻译出的蛋白也因而具备不同的结构和功能：Survivin和Survivin-3B具备完整的BIR结构域，Survivin-ΔEx3和Survivin-2α的BIR结构域被截短，而Survivin-2B的BIR结构则被隐藏外显子2b编码的肽段插入而发生断裂。

不同的剪切异构体似乎有独特的亚细胞定位和功能［1］。

Survivin-2B抗凋亡功能显著下降，呈斑点状分布于细胞质中。

Noton 等［2］构建表达Survivin-2B-GFP细胞系的实验表明，Survivin-2B 的表达可能有细胞毒性，同时有报告［3］指出强制表达Survivin-2B 会诱导癌细胞发生凋亡。

研究证实Survivin-2B与良好预后有相关性，Survivin-2B在Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌中的表达低于Ⅰ、Ⅱ期［4］说明它在结直肠癌中起负调节作用。

因此，有学者认为Survivin-2B是一种天然的Survivin拮抗剂，对患者具有保护作用。

Survivin-ΔEx3保留抗凋亡特性，主要定位于细胞核内，仅很少一部分位于线粒体内，胞浆内则无表达［5］。

Taubert等构建的多变量Cox比例风险回归模型表明Survivin-ΔEx3过度表达的肿瘤患者死亡风险会上升7.3倍［6］。

两种新发现的剪切异构体（Survivin-3B、Survivin-2α）均与凋亡有密切关系，但仍有待进一步的研究，同时不同剪切异构体对癌的差异影
响也需深入研究。

2 Survivin基因与结直肠癌的发生发展
肿瘤的形成和发展是一个多步骤多阶段的过程，该过程不但与多种癌基因、抑癌基因、逆转录酶、抗凋亡基因等的激活和凋亡基因的失活有关，而且受到它们之间的相互促进和拮抗作用的影响，机制非常复杂。

目前认为Survivin是一种同时具有调控细胞凋亡和细胞增殖双重功能的调控子［7］，该基因在抑制细胞凋亡、调节细胞周期、促进细胞增殖及细胞转化等方面均发挥着重要作用，这些作用促进了结直肠癌的发生发展。

本节着重讨论Survivin基因与结直肠癌发生发展的关系。

Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl-2家族成员。

越来越多的证据表明，Survivin 同时调控着caspase依赖的和非caspase依赖的凋亡途径。

正常成年组织的线粒体中不含Survivin池，但众多种类的癌细胞的线粒体中存在Survivin池，在细胞凋亡信号的刺激下，线粒体内的Survivin 迅速释放入胞浆，同源二聚体的形式与caspase-3或caspase-7形成稳定结合，阻止caspase激活，使二者的蛋白切割作用失效，进而抑制caspase-9介导的细胞凋亡［8］。

运用泛caspase抑制剂只能部分降低Survivin的抗凋亡能力。

有实验表明，Survivin在非caspase依赖的凋亡途径中发挥调控作用［9］。

Survivin还存在胞质
池和核内池。

利用免疫组化方法进行研究过程中，发现某些抗体只能识别二者之一，而部分抗体可同时识别两者。

这两个Survivin池各自的作用及其调控机制值得进一步探讨。

有报道［10］称结直肠癌病人如有Survivin在胞质内表达，则具有保护作用，相对危险度为0.35。

Survivin的亚细胞分布若能应用于预后评分，辅助临床医师对结直肠癌病人进行分类，则有利于实现个性化治疗。

Survivin 在调节细胞周期,促进细胞增殖方面同样发挥着重要作用。

研究［11］发现Survivin的表达与细胞增殖指标ki-67的表达呈正相关，表明Survivin 的表达与细胞的增殖密切相关。

但对Survivin 调节增殖的机制认识不一，多数研究者认为Survivin 促进细胞增殖主要与其能抑制细胞凋亡、逃避细胞凋亡点的检查、加快细胞周期的转换有关；也有研究者认为survivin 主要通过与纺锤体的微管蛋白相结合，通过有丝分裂来调节细胞周期促进转化细胞的增殖。

因此，Survivin加快细胞周期的转换、促进细胞的不断增殖，在结肠肿瘤的发生中起重要作用。

3 Survivin靶向治疗结直肠癌
Survivin仅特异性地表达于肿瘤组织而在正常成人组织几乎不表达的特性，使得应用Survivin特异性体液免疫治疗以及反应Survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。

靶向Survivin 治疗特有的优点是可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而对正常组
织几乎没有不良影响。

目前针对Survivin靶点的肿瘤治疗有4类：（1）抑制Survivin的表达，包括运用反义表达载体、反义寡核苷酸、RNA干扰(RNA interference，RNAi）、核酶、抗癌药物等；（2）针对Survivin 的免疫治疗，可以应用Survivin的cDNA、RNA、蛋白质或肽段进行免疫治疗；（3）抑制Survivin的功能，包括应用显性失活突变体、药物抑制剂、肽模拟物等；（4）应用Survivin启动子，将Survivin启动子应用于肿瘤特异性细胞毒性基因。

3.1 抑制Survivin的表达反向表达载体和人工合成反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASON）都属于反义，后者更适用于临床应用。

Penuelas等［12］发现用21-mer ASON作用于结直肠癌细胞能够提高其对化疗药物（甲氨蝶呤）的敏感度。

RNAi是指小片段的双链RNA分子介导的生物细胞内同源基因的特异性转录后基因沉默现象（poet-transcriptional gene silencing）。

小干扰RNA片段（Small interfering RNA，siRNA）具有相对于ASON有更强的效力和抗降解能力，已成为近几年的主流靶基因沉默手段。

研究［13］证明通过电穿空、局部注射或静脉注射的方法已经成功将化学合成的siRNA、表达siRNA的质粒以及病毒等导入哺乳动物，并不引起全身非特异性反应。

2004年美国FDA［14］已经批准将经过修饰的siRNA进行临床新药实验，应用于与年龄相
关的黄斑退行性改变的患者的治疗。

因此，合成针对Survivin的siRNA，并将其导入患者治疗结直肠癌，具有良好的临床治疗前景。

核酶是具有特异核酸降解能力的RNA小分子。

某些锤头酶可以特异性地降解Survivin的mRNA，但此法主要应用于实验室，距临床应用还有很大距离。

非甾体抗炎药Sulindac能持续抑制Survivin在mRNA和蛋白水平上的表达，对结直肠癌有抑制能力和预防作用［15］。

具体机制可能是上调Wnt通路的APC蛋白及下调β-catenin：前者的上调可以直接抑制Survivin的表达，后者的下调会减少T细胞因子(T-cell factor，Tcf)的激活，从而使得转录激活子β-catenin/Tcf复合体的靶基因Survivin随之下调。

3.2 针对Survivin的免疫治疗Casati等选择的一段Survivin 十肽具有很强的HLA-A2结合能力，是一种很有价值的肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）。

该抗原应用于结直肠癌病人后，能在其外周血中检测到特异的CD8+T细胞和CD4+T细胞。

因为Survivin在癌细胞以外的正常组织中沉默，且与病程进展无关，所以选择该靶点十分理想。

另有报道指出在很多肿瘤患者的外周血中都有Survivin-2B80-88特异的细胞毒性T细胞，很有希望成为HLA-A24+肿瘤患者的强效肿瘤疫苗［16］。

已进行的Ⅰ期临床试验证实这种疫苗可以降低结直肠癌患者的血清肿瘤标志物CEA、CA19-9或停止上
升，并且未观察到严重不良事件，证明了该疫苗的安全性［17］。

确定最有效的内生性蛋白酶体加工修饰出的Survivin肽段是靶向Survivin的免疫治疗亟待解决的问题。

但是实验［18］发现Survivin在结直肠癌细胞中与Fas配体的表达有相关关系，且结直肠癌细胞能通过表达功能性Fas配体主动杀伤T细胞，因此抑制Survivin的表达可在一定程度上解决结直肠癌细胞主动逃避免疫监视的问题。

不同起源的Survivin阳性肿瘤似乎可以处理和呈递出相同类型的Survivin衍生肽段抗原决定簇，这也为从其他肿瘤中制备针对结直肠癌的Suvivin衍生疫苗提供了可能。

3.3 抑制Survivin的功能有丝分裂起始蛋白cdc2对Survivin 的第34位苏氨酸（T34）磷酸化后，后者才能发挥其抗凋亡的功能。

应用药物抑制剂（purvalanol A）、基因修饰或分子靶向攻击等抑制cdc2活性的手段均能导致癌细胞的大规模凋亡。

周期素依赖激酶抑制剂flavopiridol能够抑制p34cdc2，从而阻断Survivin的T34磷酸化，进而诱导癌细胞凋亡；多柔比星能上调Survivin-2B，同时下调Survivin和Survivin-ΔEx3，与flavopiridol的作用有协同效应，可诱导细胞凋亡并抑制嫁接癌的生长；化疗药奥沙利铂可以显著抑制结直肠癌细胞Survivin的表达，提高癌细胞对紫杉醇的反应。

显性失活突变体主要有两种：一种是针对Survivin被cdc2
磷酸化的位点的Survivin T34A（第34位苏氨酸突变为丙氨酸）；另一种是BIR结构发生断裂的Survivin C84A（第84位半胱氨酸突变为丙氨酸）。

显性失活突变体虽可诱导结直肠癌细胞自发凋亡，抑制体内肿瘤生长，也能提高紫杉醇诱导的凋亡，但在临床应用中尚存在困难［19］。

运用肽模拟物shepherdin［20］，以Hsp90和Survivin的结合点为靶点，能在不影响正常细胞的成活力的前提下诱导强烈的凋亡。

实验表明，该方法可以抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，且未发现明显毒性。

3.4 Survivin启动子应用实验用Survivin启动子促进人分泌型碱性磷酸酶，结果表明Survivin启动子的活性在癌细胞中比在正常细胞中强，它的结构能够促进具备自身催化能力的Rev-caspase 3基因表达，并特异性地杀伤癌细胞，对正常细胞没有影响。

不过，由于启动子的特异性不高，往往有众多靶基因，所以靶向性不够理想，存在影响其他基因正常表达的风险。

4 Survivin 与结直肠癌预后关系
影响肿瘤预后的因素很多，其中肿瘤是否发生转移与预后密切相关。

正常细胞脱离原来的组织时会启动凋亡过程，导致细胞死亡，因而不会形成远离部位的异常增生。

Sarela等研究认为，在恶性肿瘤中，脱落的癌细胞因为Survivin对凋亡的抑制而受到了保护得以
继续存活并分裂增殖，进而形成肿瘤邻近或远离部位的转移，使病人预后不良。

Sarela对结直肠癌的研究显示，Survivin阳性患者术后5年生存率为53％．显著低于Survivin阴性患者(77.7％)；而Survivin 阳性患者术后复发率及复发死亡率均显著高Survivin阴性患者。

因此可以认为Survivin阳性表达是导致预后不良的一个危险因素。

5 总结
综上所述，作为新近发现的抗凋亡因子，Survivin的基因结构和作用机制的独特性使得有关该基因与肿瘤的研究倍受人们的关注。

本文着重分析了Survivin基因靶向治疗结直肠癌的方法，通过分析看到，Survivin基因具有良好的靶向性、特异性及安全性。

因此，对该基因展开研究具有很高的理论研究和临床应用的价值。

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