糖化酶活力测定

糖化酶活力测定

1.原理

固体曲中糖化酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。糖化酶活力高，淀粉利用率就高。

可溶性淀粉经糖化酶催化水解产生葡萄糖，用斐林试剂法测定。

2.试剂

（1）20g/L 可溶性淀粉溶液：准确称取绝干计的可溶性淀粉2g（准确至0.001g），于50mL烧杯中，用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的烧杯中，并用20mL 水分次洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配置使用。

（2）2.5g/L葡萄糖溶液

（3）斐林试剂

（4）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6）

a.2mol/L 乙酸溶液：取118mL冰乙酸，用水稀释至1000mL。

b.mol/L 乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠（CH3COOH·3H2O），溶于水并稀释至1000mL。

将a，b等体积混合，即为pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

（5）0.5mol/L H2SO3 溶液：量取28.3mL 浓硫酸，缓慢倒入水中并稀释至1L。（6）1 mol/L NaOH 溶液。

3.测定步骤

（1）5%干曲浸出液制备

称取相当于5g的干曲的曲粉（准确至0.01g）［曲粉量（g）=5×1/（1－水分含量）］，置于250mL烧杯中，加水（90－5×水分%）mL，缓冲液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min 搅拌1次。然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清滤液备用。

（2）糖化液制备

吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min 后，准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。立即加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，以停止反应。再冷却到室温，用水定容至刻度线。此时溶液应呈碱性。

空白液制备：吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min后，先加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，再准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。冷却到室温，定容。此时溶液应呈碱性。

（3）糖分测定

斐林试剂法，先取适量糖化液于斐林试剂中，用标准葡萄糖溶液滴定。

4.计算

糖化酶活力定义：1g 干曲在35℃、pH4.6条件下，反应1h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖1mg 所需的酶量称为1个酶活单位（U/g）。

糖化酶活力（U/g）=（V0－V）×c×（100/5）×（100/10）×（1/5）×1000

式中：V0 — 5mL 空白液消耗标准葡萄糖液的体积，mL；V — 5mL 糖化液消耗标准葡萄糖液的体积，mL；

c —标准葡萄糖液浓度，g/mL；

5 —测糖时吸取糖化液的体积，mL；

100 —糖化液体积，mL；

10 —糖化时吸取酶浸出液体积，mL；

100 —酶浸出液体积，mL；

5 —干曲质量；

1000 —换算成mg。