病原微生物检测方法

3
三，分子生物学方法


分子生物学及分子遗传学的发展 ,使人们对微生物的 认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征 ,微 生物的检测也相应的从生化、免疫方法转向基因水 平的检测。 核酸杂交法 PCR及其衍生技术 基于16S rRNA的检测技术
4
四，分子生物学与免疫学相结合的方法


免疫 PCR (immuno polymerase chain reaction , IM PCR) PCR-ELISA

12
检测灰飞虱带RBSDV的DIBA法
1,NC膜用铅笔画出0.5cm正方格 2,单头灰飞虱加100ul碳酸盐缓冲 液，用牙签捣碎，取上清2ul加样， 室温晾干
4,取出NC膜，浸入用封闭液稀释 10000倍的单抗体中，37 ℃,1.5h
3,将干燥的NC膜浸入封闭液中， 37 ℃,30min
5,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每 次5min
14
斑点杂交
被广泛用于检测植物或介体带毒及核酸同源性。如 果用于检测RNA样品，称为Northern杂交；如果用于 检测DNA样品，称为Southern杂交。操作程序如下： 1,从病株材料中提取少量汁液。如果病毒核酸为双链， 通过加热使其变性。 2,点样。将病株汁液滴在NC膜上或尼龙膜上。 3,烘烤纤维素膜，使核酸牢固地结合到纤维膜上。 4,用蛋白和非特异性小分子DNA溶液混合进行预杂交约 2小时，封闭膜上的非特异性位点。 5,用标记的核酸探针与膜上样品在封闭塑料袋中进行杂 交过夜，水浴65℃。洗膜后进行放射自显影分析。

6
六，生物芯片
生物芯片技术是将生物大分子,如寡核苷酸 cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固 定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙 膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样 品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂 交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪 对杂交信号进行检测和分析。 根据芯片上探针的分子种类而将之分为： DNA 芯片(即基因芯片) 和蛋白质芯片。
9
荧光抗体技术
荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的 特异性,把荧光素作为抗原标记物,在荧光显微 镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及 其存在部位。 直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧 光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观 察结果。间接法是在检测样品上滴加已知的细 菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标 记的第二抗体。
6,将膜浸入用封闭液稀释5000倍 的酶标二抗中， 37 ℃,1.5h
8,将膜浸入HRP底物显色液中， 37 ℃,30min，显色后，用自来水冲洗， 室温晾干
7,取出膜，用0.01MPBST洗3次， 每次5min
13
核酸杂交法

原理：是通过标记根据病原体核酸片段制备的 探针，与病原体核酸片段杂交,观察是否产生 特异的杂交信号。核酸杂交有原位杂交、打点 杂交、斑点杂交、Southern 杂交、 Northern 杂交等。核酸分子探针又可根据它 们的来源和性质分为DNA 探针、cDNA 探针、 RNA 探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等。
5
五，用生物传感器进行病原微生物的鉴定
生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断 技术相结合而成的一种新技术。生物传感器包 含两部分,即分子识别器件和换能器。 利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应,使用集成 化SPR 传感器快速检测大肠杆菌O157 : H7 , 采用亲和素- 生物素系统放大检测的反应信号, 并引入复合抗体作为二次抗体,使该传感器对 大肠杆菌的检测限由106 cfu/ ml 下降到105 cfu/ ml。

7
七，蛋白质指纹图谱技术
蛋白质指纹图谱技术用于各种疾病特异性蛋白指 纹的识别和判断,可以直接检测不经处理的尿液、 血液或细胞裂解液等。人体血清里有成千上万个 蛋白,人一旦发生了某种疾病,蛋白质成分就必然 会起变化。 可以分析得出SARS与非SARS 病人血清中的蛋白 质成分变化。该技术不是利用单独的蛋白质峰的 出现和消失来判断SARS ,而是用5 个蛋白质峰的 出现和消失来判断,好比刑侦破案中甄别5 个手指 的指纹,故此称为“指纹图谱”。

8
八，LAMP技术


环介导等温扩增(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一 种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传 统PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温 扩增。且由于LAMP反应中产生大量的副产物一 白色焦磷酸钾沉淀，扩增产物可不经过电泳，通 过肉眼观察或浊度计即可判定结果。 用于检测：丙型肝炎病毒(HCV) 、严重急性呼吸 综合征冠状病毒(SARS—CoV) 、乙脑病毒(JEV) 、 甲型流感病毒(AIV) 、 腮腺炎病毒(MV)等。
2
二，血清免疫学方法



免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究 组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技术。为了 显示和观察这种抗原抗体反应,需要预先将某种标记 物结合到抗体上,借标记物的荧光或酶的有色反应、 放射性或高电子密度,在光镜或电镜下进行定性、定 位或定量研究。 荧光抗体技术 酶联免疫技术

11
酶联免疫技术Βιβλιοθήκη 酶联免疫技术是根据抗原- 抗体的免疫反应与酶 的高效催化作用原理有机结合,通过酶催化底物进 而发生一系列的化学反应,使溶液呈现出颜色变化, 从而显示抗原抗体特异性反应的存在。 Dot-ELISA法（DIBA法）： Dot-ELISA 以纤维 素膜代替常规ELISA 中常用的聚苯乙烯酶标板， 这种微孔滤膜对样品吸附量大，且包被牢固，所 以样品用量少，试验结果可通过颜色斑点的出现 与否和色泽进行判定，不需特殊仪器。
病原微生物检测方法
一，生物化学方法


原理：生化方法检测病原微生物实际上是测定微生 物特异性酶。由于各种微生物所具有的系统不完全 相同 ,对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用 不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物 内酶的有无 ,从而达到检测特定微生物的目的。 辛酯酶法：快速检测沙门氏菌。沙门氏菌能产生辛 酯酶,这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌 所不具备的。以4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)为底物, 经沙门氏菌的辛酯酶降解后,释放出4-甲基伞形酮 (4MU),在紫外灯下观察其发出的蓝色荧光。