重组体的筛选与鉴定优秀课件
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法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
1. 遗传学选择法（genetic selection）：主要是根据受体细胞接 受了重组DNA分子后所发生的遗传表型变化直接选择重组体的 方法。
2. 抗药性、显色、营养缺陷等
2. 物理筛选方法：
3. 核酸杂交法 4. 表达产物分析法
PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化 子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引 物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞 克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别 同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法 成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆〔‘〕。随 后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2 基因进行了定点突变〔’〕；Zimmer等用PCR方法筛选 出同源异型盒基因hoxl.l定 点突变的ES细胞克隆，并得 到含该突变的嵌合体小鼠
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
重组体的筛选与鉴定优秀课件
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
转化率的影像因素
1. 载体DNA及DNA重组方面
载体自身性质，不同载体的转化效率不同 载体分子的空间构象（超螺旋与线性）
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
1. 遗传学选择法（genetic selection）：主要是根据受体细胞接 受了重组DNA分子后所发生的遗传表型变化直接选择重组体的 方法。
2. 抗药性、显色、营养缺陷等
2. 物理筛选方法：
3. 核酸杂交法 4. 表达产物分析法
PCR方法建立以后，很快应用于基因靶位操作中转化 子的筛选。通过在目的突变基因中引人特定的PCR引 物顺序，利用PCR方法直接检测转化细胞组份或细胞 克隆的DNA结构，以特定扩增DNA片段的有无，鉴别 同源重组细胞克隆。Kim和Smithes首先应用PCR方法 成功筛选出ES细胞Hprt基因的定点突变克隆〔‘〕。随 后，Joyner等应用同样的方法，对小鼠ES细胞的en-2 基因进行了定点突变〔’〕；Zimmer等用PCR方法筛选 出同源异型盒基因hoxl.l定 点突变的ES细胞克隆，并得 到含该突变的嵌合体小鼠
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
重组体的筛选与鉴定优秀课件
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
转化率的影像因素
1. 载体DNA及DNA重组方面
载体自身性质，不同载体的转化效率不同 载体分子的空间构象（超螺旋与线性）