杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究
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1.2 方法
1.2.1 溶磷菌的分离纯化 将各年生杉木根际土壤，利用蒙金娜有机无机
培养基进行分离。称取样品 5 g 置于三角瓶中加入 已灭菌的 45 mL 蒸馏水，振荡 30 min，制成悬浮液， 取 1 mL 注入盛有 9 mL 无菌蒸馏水的试管中，震荡 混匀，再从此试管中吸取 1 mL，注入另一支盛有 9 mL 无菌蒸馏水的试管中，以此类推，最后制成浓 度为 10-4、10-5、10-6 的梯度溶液。取 50 μL 涂布于 蒙金娜有机无机培养基上 , 每个梯度重复 3 个培养 皿，并作好标记 [4-5]。在 28 ℃条件下培养 2 ～ 7 d。 1.2.2 溶磷菌溶磷性能的定性分析
光值 0.5 悬浮液 , 按 2% 分别接种于 50 mL 蒙金娜 有机和无机液体培养基中 ( 对照接种无菌蒸馏水 ), 3 次重复 , 置 28 ℃ 160 r/min 摇床培养，发酵 12 d 后， 在 4 ℃ 10 000 r/min 离心 10 min, 取 5 mL 上清液用 钼锑抗比色法测定在 700 nm 波长下的吸光度，并 计算有效磷的增量 [6-7] ，同时测定 pH 值。 1.2.4 分泌生长素的定性测定
利用 5 点取样法对杉木 1 年生，5 年生，10 年生， 18 年生，25 年生 5 块标准地采样 , 采取 20 ～ 40 cm 根际土壤装入未拆封的保鲜袋中贴上标签进行 封口，最后放入冰筒带回实验室进行溶磷菌分离。 1.1.3 培养基
实验采用 LB 培养基、蒙金娜有机无机培养基， king 氏培养基 。 [2-3]
ห้องสมุดไป่ตู้ 96
李 蓉，等：杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究
第4期
株，为制作解磷生物菌肥并提高土壤磷利用效率 提供一些依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 采样地自然概况 样地位于湖南攸县 (27°01′ ～ 27°07′N, 113°27′
～ 113°32′E) 海 拔 300 ～ 1 404.9 m 之 间。 该 地 区 位 于 中 亚 热 带 季 风 湿 润 气 候 区， 属 亚 热 带 季 风湿润气候，雨水充足，土壤肥沃。年平均气温 17.8 ℃， 年 降 水 量 1 410.8 mm， 无 霜 期 292 d 左 右。年蒸发量 1 261~1 388 mm, 相对湿度 70% ～ 74%。地貌类型以中低山为主，坡度 20° ～ 35°。 地带性土壤为山地黄红壤。 1.1.2 土壤样品的采集
第 32 卷
中南林业科技大学学报
97
表 1 不同解磷细菌菌株的特征 Table 1 Strains characters of different phosphate
将 1.2.4 中 与 对 照 颜 色 相 似 的 菌 株 采 用 Salkowski 比色法 [8]，用分光光度计测定在 530 nm 下的吸光度并计算 IAA 分泌量。 1.2.6 统计分析
试验数据采用 Excel 和 DPS 进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 溶磷菌分离与筛选
本试验从株洲攸县杉木人工林的根际土壤中 分离筛选出溶磷菌 , 共获得有机溶磷菌株 30 株， 无机磷 42 株。根据透明圈直径 (D)/ 菌落大小 (d) 的比值，分离筛选出 D/d 大于 1.6 的解有机磷和无 机磷菌株各 12 株 ( 见表 1)。
( 中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004)
摘 要： 利用蒙金娜有机和无机培养基，各筛选出 12 株具有较大溶磷圈的菌株，用钼锑抗比色法和 Salkowski
比色法分别对溶磷特性和分泌 IAA 能力进行研究。结果表明：溶解有机磷能力最强的是 Py16,Py10 和 Py3( 分别
将 1.2.3 中悬浮液 , 取 1 mL 接种于 50 mLking 氏培养基中 , 每一菌株设 3 次重复 , 置于 28 ℃ 160 r/min 摇床培养，发酵 12 d。取发酵液 100 μL 滴放 在白瓷板上并加等量 Salkowski 比色液。对照只在 比色液中加入等量 50 μg/mg 的 IAA。将白瓷板放 于黑暗处 30 min 后观察其颜色变化，颜色变粉红 或者与对照颜色相似为阳性，反之为阴性 [7]。 1.2.5 分泌 IAA 能力的定量测定
从表 1 可以看出 , 根据溶磷圈法可以初步判断 其解磷情况，溶磷能力较强的菌株 (D/d ≥ 2.5) 解 有机磷菌株有 3 株即 Py16、Py1、Py29，占有机 磷菌总数的 25%，无机磷 1 株，溶磷能力强的菌 株 (D/d=1.7 ～ 2.0) 解有机磷菌株有 5 株即 Py3、 Py24、Py27、Py18、 和 Py10 占 有 机 磷 菌 总 数 41.67%，解无机磷菌 11 株都在此范围。其余 4 个 有机磷菌株 D/d 值范围介于 1.6 ～ 1.7。这样筛选 出来的菌株具有一定溶磷力 , 有机磷菌株 D/d 值之 间差异较大，而无机磷菌株 D/d 值之间差异相对 较小，主要分布在 1.8 ～ 2.5 之间。本研究中的 D/ d 值与林启美等测得假单胞菌属的 D/d 值相仿。菌 株在固体培养基上溶磷圈直径 (D) 与菌落直径 (d) 的比值 (D/d 值 ) 的这种变化可能与菌株代谢产物
L,37.29 mg/L 和 35.79 mg/L)，无机磷菌是 Pw6 ，Pw8， Pw21( 分别是 45.340 mg/L，39.340 mg/L，27.480 mg/L)。
综合这些结果 , 菌株 Py16，Py3 和 Pw6 兼有解磷和分泌 IAA 两种最强或较强能力，在多功能微生物菌肥研制中
LI Rong, ZHOU De-ming, WU Yi, ZHOU Guo-ying, HUANG Peng-fei, DENG Xiao-jun
(School of Life Sciences and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China) Abstract: By respectively using Mengjinna organic and inorganic mediums，screening out bigger 12 bacterial strains from each kind of medium(total 24 strains)，the phosphate-solubilizing characteristics and IAA secretion ability of 24 strains of phosphate-solubilizing bacteria were studied by using both Molybdenum antimony resistance colorimetric method and Salkowski colorimetric method. The results show that the strains Py10, Py16 and Py3 had the maximum capacity to solubilize phosphate，respectively being 7.13 1 mg/100 mL, 5.90 7 mg/100 mL and 6.514 mg/100 mL) : the strains Pw10，Pw6，Pw20 had the maximum capacity to solubilize inorganic phosphate，respectively being 23.2 mg/100 mL, 18.59 mg/100 mL，and 17.26 mg/100 mL；the strains Py18，Py16 and Py3 had the maximum capacity to secrete inorganic phosphate bacteria，respectively being 38·80mg/L,37.29 mg/L 和 35.79 mg/L；the strains Pw6 ，Pw8，Pw21 had the maximum capacity to secrete inorganic phosphate bacteria，respectively being 45.340 mg/L，39.340 mg/L， 27.480 mg/L. Consequently, the strains Py16，Py3and Pw6 had both ability of phosphorus-dissolving and IAA-producing, thus they have high utilization value in developing multiple-effective microbial fertilizer. Keywords: phosphate solubilizing bacteria; screening; phosphorus solubilizing capability; auxin(IAA)
为 7.131 mg/100 mL,5.907 mg/100 mL 和 6.514 mg/100 mL)；无机磷的是 Pw10，Pw6，Pw20 分别是 23.20 mg/100
mL，18.59 mg/100 mL，17.26 mg/100 mL。分泌 IAA 最大的是有机磷菌是 Py18，Py16 和 Py3( 分别为 38.80 mg/
制约了人工林可持续发展。所以研究出一种适合 杉木生长的生物菌肥，是研究者迫切做的一项科 研。在植物根际存在一些微生物，不仅可通过代 谢增加土壤中有效磷含量，同时还可分泌生长素， 促进植物生长。本研究是从杉木根际和根系表面 土壤中分离筛选出的溶磷细菌，研究它们的溶磷 能力和分泌 IAA 的能力，希望从中筛选出优良菌
磷元素是植物生长发育必需的营养元素之一， 并且植物对磷的需求又主要是从土壤中吸收，然 而土壤中 95% 以上的磷植物难以直接吸收利用， 因此，植物对磷元素的需求常常成为限制作物生 长和产量的主要元素之一 [1]，杉木是我国特有的 速生针叶用材林树种，其人工纯林连栽引起地力 严重衰退其生产力逐年下降。土壤 N、P 缺乏严重
第 32 卷 第 4 期 2012 年 4 月
中南林业科技大学学报 Journal of Central South University of Forestry & Technology
Vol. 32 No. 4 Apr. 2012
杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究
李 蓉，周德明，吴 毅，周国英，黄鹏飞，邓小军
收稿日期：2011-04-22 基金项目：国林业公益性行业科研专项经费项目 (200904006,201004014)；国家林业局 948 项目 (2009-4-30) 作者简介：李 蓉 (1984—)，女，四川遂宁人，硕士研究生，主要从事生物菌肥方面的研究；E-mail：lirong4404@163.com 通讯作者：周德明 (1964—)，男，湖南衡阳人，副教授，主要从事应用微生物研究
蒙金娜有机无机培养基上生长的菌株，选取 具有溶磷圈的菌株，置于 28 ℃培养箱中培养 10 d,
记录溶磷圈直径 (D) 与菌落直径 (d)。采用溶磷 圈法 (D/d 值 ) 对溶磷菌的溶磷性能进行定性测试， 筛选出 D/d 值较大的，用 LB 斜面培养基保存备用。 1.2.3 溶磷菌的溶磷量测定
将 1.2.2 节中获得的菌株活化培养制成 OD660 吸
具有重要利用价值。
关键词： 溶磷菌；筛选；溶磷能力；生长素
中图分类号：S791.27
文献标志码：A
文章编号： 1673-323X(2012)04-0095-05
Selection and characteristics of phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere of Cunninghaimia lanceolata
1.2.1 溶磷菌的分离纯化 将各年生杉木根际土壤，利用蒙金娜有机无机
培养基进行分离。称取样品 5 g 置于三角瓶中加入 已灭菌的 45 mL 蒸馏水，振荡 30 min，制成悬浮液， 取 1 mL 注入盛有 9 mL 无菌蒸馏水的试管中，震荡 混匀，再从此试管中吸取 1 mL，注入另一支盛有 9 mL 无菌蒸馏水的试管中，以此类推，最后制成浓 度为 10-4、10-5、10-6 的梯度溶液。取 50 μL 涂布于 蒙金娜有机无机培养基上 , 每个梯度重复 3 个培养 皿，并作好标记 [4-5]。在 28 ℃条件下培养 2 ～ 7 d。 1.2.2 溶磷菌溶磷性能的定性分析
光值 0.5 悬浮液 , 按 2% 分别接种于 50 mL 蒙金娜 有机和无机液体培养基中 ( 对照接种无菌蒸馏水 ), 3 次重复 , 置 28 ℃ 160 r/min 摇床培养，发酵 12 d 后， 在 4 ℃ 10 000 r/min 离心 10 min, 取 5 mL 上清液用 钼锑抗比色法测定在 700 nm 波长下的吸光度，并 计算有效磷的增量 [6-7] ，同时测定 pH 值。 1.2.4 分泌生长素的定性测定
利用 5 点取样法对杉木 1 年生，5 年生，10 年生， 18 年生，25 年生 5 块标准地采样 , 采取 20 ～ 40 cm 根际土壤装入未拆封的保鲜袋中贴上标签进行 封口，最后放入冰筒带回实验室进行溶磷菌分离。 1.1.3 培养基
实验采用 LB 培养基、蒙金娜有机无机培养基， king 氏培养基 。 [2-3]
ห้องสมุดไป่ตู้ 96
李 蓉，等：杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究
第4期
株，为制作解磷生物菌肥并提高土壤磷利用效率 提供一些依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 采样地自然概况 样地位于湖南攸县 (27°01′ ～ 27°07′N, 113°27′
～ 113°32′E) 海 拔 300 ～ 1 404.9 m 之 间。 该 地 区 位 于 中 亚 热 带 季 风 湿 润 气 候 区， 属 亚 热 带 季 风湿润气候，雨水充足，土壤肥沃。年平均气温 17.8 ℃， 年 降 水 量 1 410.8 mm， 无 霜 期 292 d 左 右。年蒸发量 1 261~1 388 mm, 相对湿度 70% ～ 74%。地貌类型以中低山为主，坡度 20° ～ 35°。 地带性土壤为山地黄红壤。 1.1.2 土壤样品的采集
第 32 卷
中南林业科技大学学报
97
表 1 不同解磷细菌菌株的特征 Table 1 Strains characters of different phosphate
将 1.2.4 中 与 对 照 颜 色 相 似 的 菌 株 采 用 Salkowski 比色法 [8]，用分光光度计测定在 530 nm 下的吸光度并计算 IAA 分泌量。 1.2.6 统计分析
试验数据采用 Excel 和 DPS 进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 溶磷菌分离与筛选
本试验从株洲攸县杉木人工林的根际土壤中 分离筛选出溶磷菌 , 共获得有机溶磷菌株 30 株， 无机磷 42 株。根据透明圈直径 (D)/ 菌落大小 (d) 的比值，分离筛选出 D/d 大于 1.6 的解有机磷和无 机磷菌株各 12 株 ( 见表 1)。
( 中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004)
摘 要： 利用蒙金娜有机和无机培养基，各筛选出 12 株具有较大溶磷圈的菌株，用钼锑抗比色法和 Salkowski
比色法分别对溶磷特性和分泌 IAA 能力进行研究。结果表明：溶解有机磷能力最强的是 Py16,Py10 和 Py3( 分别
将 1.2.3 中悬浮液 , 取 1 mL 接种于 50 mLking 氏培养基中 , 每一菌株设 3 次重复 , 置于 28 ℃ 160 r/min 摇床培养，发酵 12 d。取发酵液 100 μL 滴放 在白瓷板上并加等量 Salkowski 比色液。对照只在 比色液中加入等量 50 μg/mg 的 IAA。将白瓷板放 于黑暗处 30 min 后观察其颜色变化，颜色变粉红 或者与对照颜色相似为阳性，反之为阴性 [7]。 1.2.5 分泌 IAA 能力的定量测定
从表 1 可以看出 , 根据溶磷圈法可以初步判断 其解磷情况，溶磷能力较强的菌株 (D/d ≥ 2.5) 解 有机磷菌株有 3 株即 Py16、Py1、Py29，占有机 磷菌总数的 25%，无机磷 1 株，溶磷能力强的菌 株 (D/d=1.7 ～ 2.0) 解有机磷菌株有 5 株即 Py3、 Py24、Py27、Py18、 和 Py10 占 有 机 磷 菌 总 数 41.67%，解无机磷菌 11 株都在此范围。其余 4 个 有机磷菌株 D/d 值范围介于 1.6 ～ 1.7。这样筛选 出来的菌株具有一定溶磷力 , 有机磷菌株 D/d 值之 间差异较大，而无机磷菌株 D/d 值之间差异相对 较小，主要分布在 1.8 ～ 2.5 之间。本研究中的 D/ d 值与林启美等测得假单胞菌属的 D/d 值相仿。菌 株在固体培养基上溶磷圈直径 (D) 与菌落直径 (d) 的比值 (D/d 值 ) 的这种变化可能与菌株代谢产物
L,37.29 mg/L 和 35.79 mg/L)，无机磷菌是 Pw6 ，Pw8， Pw21( 分别是 45.340 mg/L，39.340 mg/L，27.480 mg/L)。
综合这些结果 , 菌株 Py16，Py3 和 Pw6 兼有解磷和分泌 IAA 两种最强或较强能力，在多功能微生物菌肥研制中
LI Rong, ZHOU De-ming, WU Yi, ZHOU Guo-ying, HUANG Peng-fei, DENG Xiao-jun
(School of Life Sciences and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China) Abstract: By respectively using Mengjinna organic and inorganic mediums，screening out bigger 12 bacterial strains from each kind of medium(total 24 strains)，the phosphate-solubilizing characteristics and IAA secretion ability of 24 strains of phosphate-solubilizing bacteria were studied by using both Molybdenum antimony resistance colorimetric method and Salkowski colorimetric method. The results show that the strains Py10, Py16 and Py3 had the maximum capacity to solubilize phosphate，respectively being 7.13 1 mg/100 mL, 5.90 7 mg/100 mL and 6.514 mg/100 mL) : the strains Pw10，Pw6，Pw20 had the maximum capacity to solubilize inorganic phosphate，respectively being 23.2 mg/100 mL, 18.59 mg/100 mL，and 17.26 mg/100 mL；the strains Py18，Py16 and Py3 had the maximum capacity to secrete inorganic phosphate bacteria，respectively being 38·80mg/L,37.29 mg/L 和 35.79 mg/L；the strains Pw6 ，Pw8，Pw21 had the maximum capacity to secrete inorganic phosphate bacteria，respectively being 45.340 mg/L，39.340 mg/L， 27.480 mg/L. Consequently, the strains Py16，Py3and Pw6 had both ability of phosphorus-dissolving and IAA-producing, thus they have high utilization value in developing multiple-effective microbial fertilizer. Keywords: phosphate solubilizing bacteria; screening; phosphorus solubilizing capability; auxin(IAA)
为 7.131 mg/100 mL,5.907 mg/100 mL 和 6.514 mg/100 mL)；无机磷的是 Pw10，Pw6，Pw20 分别是 23.20 mg/100
mL，18.59 mg/100 mL，17.26 mg/100 mL。分泌 IAA 最大的是有机磷菌是 Py18，Py16 和 Py3( 分别为 38.80 mg/
制约了人工林可持续发展。所以研究出一种适合 杉木生长的生物菌肥，是研究者迫切做的一项科 研。在植物根际存在一些微生物，不仅可通过代 谢增加土壤中有效磷含量，同时还可分泌生长素， 促进植物生长。本研究是从杉木根际和根系表面 土壤中分离筛选出的溶磷细菌，研究它们的溶磷 能力和分泌 IAA 的能力，希望从中筛选出优良菌
磷元素是植物生长发育必需的营养元素之一， 并且植物对磷的需求又主要是从土壤中吸收，然 而土壤中 95% 以上的磷植物难以直接吸收利用， 因此，植物对磷元素的需求常常成为限制作物生 长和产量的主要元素之一 [1]，杉木是我国特有的 速生针叶用材林树种，其人工纯林连栽引起地力 严重衰退其生产力逐年下降。土壤 N、P 缺乏严重
第 32 卷 第 4 期 2012 年 4 月
中南林业科技大学学报 Journal of Central South University of Forestry & Technology
Vol. 32 No. 4 Apr. 2012
杉木根际溶磷菌筛选及其部分特性的初步研究
李 蓉，周德明，吴 毅，周国英，黄鹏飞，邓小军
收稿日期：2011-04-22 基金项目：国林业公益性行业科研专项经费项目 (200904006,201004014)；国家林业局 948 项目 (2009-4-30) 作者简介：李 蓉 (1984—)，女，四川遂宁人，硕士研究生，主要从事生物菌肥方面的研究；E-mail：lirong4404@163.com 通讯作者：周德明 (1964—)，男，湖南衡阳人，副教授，主要从事应用微生物研究
蒙金娜有机无机培养基上生长的菌株，选取 具有溶磷圈的菌株，置于 28 ℃培养箱中培养 10 d,
记录溶磷圈直径 (D) 与菌落直径 (d)。采用溶磷 圈法 (D/d 值 ) 对溶磷菌的溶磷性能进行定性测试， 筛选出 D/d 值较大的，用 LB 斜面培养基保存备用。 1.2.3 溶磷菌的溶磷量测定
将 1.2.2 节中获得的菌株活化培养制成 OD660 吸
具有重要利用价值。
关键词： 溶磷菌；筛选；溶磷能力；生长素
中图分类号：S791.27
文献标志码：A
文章编号： 1673-323X(2012)04-0095-05
Selection and characteristics of phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere of Cunninghaimia lanceolata