基因工程制药

5. DNA聚合酶Ⅰ大片段—— Klenow片段
Klenow片段用途
⑴ 补齐双链DNA的 3ˊ末端； ⑵ 用标记碱基补 齐3ˊ末端 ； ⑶ 用于cDNA克隆中 第二股链的合成； ⑷ DNA序列分析。
5' 3' 外切酶Ⅲ 5' 3' Klenow DNA聚合酶 5' 3' 变性 5' 3' 3' 5' [α -32P]dNTP 3' 5' 标记末端 5'-粘端 3' 双链 DNA 5'
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
+
3' 5'
标记探针
6. DNA连接酶(DNA ligase)
催 化 双 链 DNA 中 一 条 链 的 3’-OH 与 另 一 条 链 的 5’PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。
DNA连接酶的用途
（ 1）
5ˊ- ACG
两个双链DNA片段连接起来
AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 GCA-5ˊ 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ
五、基因工程制药所使用的生物技术
（1）DNA重组技术
（2）淋巴细胞杂交瘤技术
（3）细胞培养技术
（4）克隆表达技术
六、我国基因工程制药的进展
α-1b型基因工程干扰素，是我国自行研 究开发的具有国际先进水平的基因工程 药物，于1997年通过III期临床，并获得 国家一类新药证书。它源于中国人基因， 最适于黄种人使用。 目前，我国已经批准了12种基因工程药物 和疫苗上市。
DNA片断，主要产生3种末端结构：
5ˊ－粘性末端
3ˊ－粘性末端
平端或钝端
回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复; 粘性末端(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和 3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。
HindⅡ GTCGAC CAGCTG
（二）、技术上三个重要成果
1.基因工程的工具酶
1966年，发现DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜 血杆菌中分离并纯化限制性内切酶 Hind Ш，使DNA分子的 切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究 小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。
2.基因工程载体
（三）、基因工程的载体
基因工程的载体是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源 DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体(vector)
来源分类：质粒载体 噬菌体载体 用途分类：克隆载体 表达载体
病毒载体
人工染色体载体
穿梭载体
克隆载体(cloning vector)
能使插入的外源DNA序列被复制、扩增 而不能表达，这样的载体为克隆载体。
4.逆转录酶
特点
逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： ⑴
⑵
以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链
具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA
⑶
以DNA为模板，催化合成cDNA双链。
逆转录酶的应用：
⑴ ⑵ ⑶ ⑷ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； 代替Klenow酶用于DNA序列分析； 制备杂交探针等。
（三）、基因工程的研究内容
基因工程（genetic engineering ）是指在基因水 平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类 的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种 新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后 代。
二、基因工程相关概念及基本工具
（一）、基因工程的相关概念
1.克隆与克隆化 克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离 的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分 子克隆。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+
GATCC
G
(2) 分类、作用
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统：限 制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。
(3)命名
EcoRⅠ
属 种 株 序 Escherichia coli RY13株
基因工程制药
第一节 第二节 第三节 第四节
概述 基因工程基本技术与策略 基因药物生产的基本过程 基因工程药物制造实例
第一节 概述
一、基因工程建立的基础 二、基因工程的相关概念及相关酶学 三、基因工程技术所生产的药物 四、基因工程制药的优点 五、基因工程制药所使用的生物技术 六、我国基因工程制药的进展 七、基因工程制药生产的化学工艺学要求 八、基因工程的发展
*T *T
dATP,dCTP,dGTP [- 32 P] dTTP
5'
3' 5'
*T
*T
3' 5'
3.TaqDNA聚合酶
(TaqDNA polymerase) 作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75℃，
2） 95℃以上高温，半小时不失活，
3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。
（3）激素----胰岛素、生长激素、心钠 素、人脑激素。 （4）酶类----尿激酶、链激酶、葡聚糖 酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、 超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、 人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。
四、基因工程制药的优点
（1）利用基因工程技术可 以生产出过去难以获得的 生理活性蛋白和多肽。 （2）可以通过大批量的生 产方法获得足够数量的生 物活性物质。 （3）利用基因工程技术可 以发掘出更多的内源性生 理活性物质。 （4）利用基因工程技术和 蛋白质工程技术可以对药 物蛋白进行修饰和改造， 来提高药效价值和获得新 型的化合物。
⑴ 常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针； cDNA第二条链的合成； 对DNA3突出末端进行标记； DNA序列分析。
⑵ ⑶ ⑷
E. coli DNA pol. Ⅰ催化缺口平移
5'
3'
D N ase I
3'
Mg
2+
5' 3'
5'
3' 5'
E. coli DNA POL I
3'
5' 3' 5' 3'
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
2. DNA聚合酶Ⅰ （全酶）
E.Coli DNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ） 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
DNA pol Ⅰ应用
② 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接
重要的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶 （Ⅱ型） T4 DNA连接酶 DNA聚合酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 活性 识别特异碱基序列，切割DNA
催化DNA5’-磷酸与3’-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA
以RNA为模板合成cDNA 切除5’-末端磷酸 催化3’-端合成同聚尾
3ˊ- TGCTTAA
（2）
修补带有缺口的双链DNA分子
T4DNA连接酶
7.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）
能够催化水解去除DNA或RNA5’-端的磷酸基团。 用途 ⒈ 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5’
－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重
组效率。
⒉
用32P标记5’-端前，去除5’-P，再通过激酶作用把
1972年，美国斯坦福大学Berg研究小组利用限制性内切酶 EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。
1973年，科恩（Cohen） 等人用EcoR I内切酶处理 大肠杆菌的抗四环素和抗 青霉素及磺胺的质粒，并 连接成一个新的重组质粒。 将这种工程化的质粒转入 大肠杆菌，在含有四环素 和青霉素的平板中筛选重 组菌落。 同年，加利福尼亚的博耶 （Boyer）也进行了类似 的实验。 重组子转化的成功标志着 基因工程的诞生。
表达载体(expression vector)
使插入的外源DNA序列转录翻译，表达
出多肽链，这样的载体称为表达载体。
穿梭载体（shuttle vector)
这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具 备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源 片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择 标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆 的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种 受体中进行复制和表达．
一、基因工程建立的基础
（一）、理论方面的三个重要的发现 1.生物遗传物质—DNA的发现
2. DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立
1953年，沃森(Watson） 和克里克 （Crick） 首次提出 Hale Waihona Puke BaiduDNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大 地促进了现代生物科学的发展。
3.遗传信息传递方式的确立
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母，用大写； 第二、第三个字母是该细菌种名的前两个字母，用小写； 第四个字母代表菌株类型； 如果菌株有几种酶，在代表菌株的字母后用罗马数字表示。
(4)Ⅱ类酶识别序列特点——
回文结构(palindrome)
特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的
2.DNA克隆 在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子， 通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取 获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。
3.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或 DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物--蛋白质。 4.基因载体 也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现 外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻 译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆 载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。
（二）、基因工程的工具酶
克隆和进行基因操作需要对遗传物质进行剪切、修饰和连 接，这些过程都是在工具酶的催化下完成的。按功能将工 具酶分类，
可分为剪切酶类、 连接酶类和修饰酶类
如下所示
分子剪刀和分子针线
1.限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease, RE)
(1) 定义
是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链 DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶 或切割酶。
基因克隆载体必须具备三个条件
①具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。
②能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我 复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。
③必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后， 以便筛选克隆子。
④分子量小，拷贝数高。
⑤具有较高的遗传稳定性。
◆
克隆载体必需结构:
松弛型的复制子、多克隆位点、
筛选标记.
常见:质粒、噬菌体
◆
表达载体结构特点：
具有复制子，筛选标记，位于多克隆位 点的上下游具有转录效率较高的启动子， 起始密码子和核糖体结合位点，转录终 止子结构．
三、基因工程技术所生产的药物
传统方法很难生产的，主要是药用活 性蛋白质和多肽类，包括： （1）免疫蛋白质----各种抗原、单克 隆抗体、乙肝疫苗。 （2）细胞因子----各种干扰素、白细 胞介素、集落刺激生长因子、表皮生 长因子、凝血因子、促红细胞生成素。
为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特 定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌 性因子（F因子）研究。20世纪50-60年代，相继发现其他质 粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（CoE）。这些 工作为基因工程载体系统的建立打下基础。
3.基因的体外重组技术
放射性核苷酸加到5'-端进行标记。
8.末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT)
作用
将标记或未标记的 dNTP 加到 DNA 的 3’-OH 末端；也可催化 载体分子或待克隆的 DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一 步连接。
应用
① 探针标记
P32-α dGTP
.
G32G32G32G32 3´
3´ G32G32G32G32