地衣芽孢杆菌制淀粉酶

α-淀粉酶的工业化生产
保藏菌种 斜面活化 摇瓶种子 培养 粗制品 厚层通风 发酵 烘干 抽提 麸曲 种子罐扩 大培养
沉淀
收集滤液
过滤
离心
洗涤沉淀风干粉碎精来自品α-淀粉酶在工业中的应用
α－淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、 医药业、饲料业。
制糖：双酶法生产麦芽低聚糖；耐高温α食品工业
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶
菌种改良的具体措施很多，微生物菌种的育种手段和技术从最早人 们认为的微生物可“驯化”，到出现了“定向培育”技术；再到后来随 着对遗传变异现象认识的深入，出现了通过诱变剂提高诱变频率的育种 技术。 现代分子生物学技术的飞速发展,为菌种改良开辟了一条新途径。基 因工程所创造的新物种是超远缘杂交,是最新最有前途的育种方法。 盲目性、 常选用紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、 程度有限、 诱变育种：甲基磺酸乙酯(EMS)等诱变方法。 耗时长、 效果不明显
α-淀粉酶分泌表达载体构建
α-淀粉酶重组表达菌株的构建 重组发酵菌株的发酵培养
产物α-淀粉酶的分离纯化
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶 α-淀粉酶分泌表达载体构建
以枯草芽孢 杆菌的P43启 动子，以地衣 芽胞杆菌α 淀粉酶基因的 信号肽、编码 区和终止子序 列为表达原件， 构建了α -淀 粉酶分泌表达 载体pP43SAT。
α-淀粉酶产量的影响因素-培养基成分对发酵生产的影响
2 、金属离子和其他无机离子对发酵生产的影响
α－淀粉酶是一种金属酶，在发酵过程中适当地加入一些金属离子对于α－ 淀粉酶的产量 有一定的促进作用。
常见的金属离子如K+、Fe2 +、Mo2 +、Cl -等对于α－淀粉酶的产量基本没有影 响; Mg2 + 则对产量起着关键的作用，在没有添加Mg2 + 的情况下产酶量会下降 50%; Mn2 + 对于产量也会有一定的促进作用; 而Co2 + 可以使菌体量大大增加但是 会导致产量有一定的下降
面包： 适量的α-淀粉酶可改良面包的品质。 啤酒、酒精工业： α-淀粉酶热稳定性是
由蛋白质本身的热稳定性决定的，所以该酶 被广泛应用于啤酒酿造和酒精工业等。
α-淀粉酶在工业中的应用
α－淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、 医药业、饲料业。 由于淀粉廉价、易获取、易去除，所以在 现代纤维制造工艺中被用作为防止纱线断裂 而加的一层保护层材料，之后再使用α-淀粉 酶进行处理，其能有选择性地去除淀粉浆而 不伤害纱线纤维，还能使淀粉降解为易溶于 水的糊精，使其容易被洗掉。
淀粉
－ 淀 粉 酶
随 －机 ，切 断 － 糖 苷 键 α
糊精 + 低聚糖
α
1 4
α-淀粉酶在工业中的应用
α-淀粉酶可有微生物发酵产生，也可从植物和动物中提取。目前，工业生 产上都以微生物大量生产。主要的α-淀粉酶生产菌种由细菌和曲霉，尤其是枯 草杆菌为大多数工厂所采用。生产上有使用价值的产生菌有：枯草杆菌、地衣 芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、米曲霉、黑曲 霉、拟内孢霉。
37 ℃、180 r/min过夜培养
地衣芽胞杆菌（电转化生长培养基）
250 r/min、37 ℃培养 至OD600 nm为0.8～0.9
冰浴10 min，5 500 r/min离心6 min
菌体
用电转化洗涤培养基洗涤菌体3 次， 重悬于洗涤培养基中
感受态细胞
pP43SAT质粒DNA
用电脉冲转化仪 2.5 kV电击 四环素抗性平板筛选
医药研制：黑曲霉α-淀粉酶具有耐酸性，
故可用来制造帮助消化一类的药物，开发适 合于胃酸性环境的耐酸性α-淀粉酶，用于制 备消化助剂，将会使医疗效果更为有效。麦 角隐亭是用于治疗高血压和处理外周血管组 织障碍具有药理活性的生物碱，可通过α-淀 粉酶处理淀粉的水解液作为碳源，来发酵培 养麦角菌ΑTCC20019，生产麦角隐亭。
α-淀粉酶在工业中的应用
α－淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、 医药业、饲料业。
饲料业：在饲料中添加以蛋白酶、α-淀粉酶为主的复合
饲料业
饲粮中添加外 源α-淀粉酶可 以帮助幼龄动 物消化利用淀 粉，对其生长 性能与饲料转 化率十分 有益 酶制剂，可以提高断奶仔猪的生产性能和营养物质的消化 率。肉鸡日粮中添加产α-淀粉酶的活大肠杆菌培养物可以 起到抗生素生长促进剂的作用，改善肠道形态，提高生产 性能。有研究在肉鸡日粮中添加不同剂量外源α-淀粉酶， 均提高了肉鸡增重，每多添加淀粉酶1 000 U· kg-1，每羽肉 鸡多增重约10 g，并提高了21日龄肉鸡前肠内容肠淀粉酶， 总蛋白酶和胰蛋白酶活性。
水洗工业
α-淀粉酶用于 去除水洗工业 中添加的淀粉
α-淀粉酶在工业中的应用
α－淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、 医药业、饲料业。 浆糊是一种很好的纸张涂料，其能提高纸张的硬 度和强度、增强纸张的可摩擦性；在生产纸张时为了 在处理过程中让其免于机械损伤，会在处理时涂上浆 糊。当纸张穿过2个轧辊时，淀粉浆被加入纸张中， 这个过程的温度控制在45~60 ℃，需要淀粉有稳定的 黏度。而自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高， 因此，可以用α-淀粉酶部分降解淀粉来调节。
常用的碳源为可溶性 淀粉或生淀粉，氮源 有酵母提取物、大豆 粉、肉汁提取物、蛋 白胨等
考虑工业能耗 及生产成本
低成本的 农业原料
Saban等研究Bacillus amyloliquefaciensNRRL－ 645 利用蓖麻油饼发酵生产α－淀粉酶时表明；会 提高酶产量； Rajagopalan等以农业废料作为碳氮源，利用一 株枯草芽孢杆菌KCC103 进行α－淀粉酶的深层液 体发酵生产；表明会提高酶产量。 刘仲敏等在研究米曲霉ZLF13 固态发酵时发现 麸皮中淀粉的含量会影响到最终α－ 淀粉酶的产 量。
发酵液
6 层纱布过滤, 6 000 r/min离心15 min, 收集上清
粗酶液
调至pH至 6.0 ,冰浴 中无水乙醇沉淀
粗酶蛋白沉淀
离心、除乙醇、透析
透析后的酶液
CM52纤维素柱层析
干燥
α-淀粉酶
α-淀粉酶产量的影响因素
培养基成分对发 酵生产的影响 发酵条件的影响 其他影响因素
1、碳氮源对发酵生产 的影响 2、金属离子等无机离 子对发酵生产的影响 3、生长因子对发酵生 产的影响
1、温度的影响 2、pH 的影响
生产工艺流程等也会对 产量有很大影响。
3、溶氧的影响
α-淀粉酶产量的影响因素-培养基成分对发酵生产的影响
1、碳氮源对发酵生产的影响
在α－ 淀粉酶发酵生产中常用的 碳源为可溶性淀粉或生淀粉，常用 的氮源有酵母提取物、大豆粉、肉 汁提取物、蛋白胨等。但是，从工 业能耗和生产成本考虑，越来越多 的生产厂家开始用一些低成本又能 提供良好碳氮源的农业废料如麸皮、 油饼来替代成本较高的可溶性淀粉、 酵母膏和蛋白胨等精细碳氮源。尽 管麸皮等残料在颗粒大小、碳氮比 例上参差不齐，同时这类残料含有 一些未知的杂质，然而这些替代品 不但能提供丰富的营养，而且成本 十分低廉，经过研究和优化可以成 为良好的碳氮源。利用低成本的农 业原料将是以后大规模发酵生产的 趋势
重组发酵菌株
接种到含四环素（20 μg/mL） 的LB培养基中 37 ℃、180 r/min培养过夜 转接至新鲜的LB培养基中，直到 OD600 nm为1.0时，以1%的接种量 接种到新鲜的淀粉酶发酵培养基中 37 ℃、180 r/min培养过夜
收集产物α-淀粉酶
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶 产物α-淀粉酶的分离纯化
菌 种 改 良
基因工程： 方法对地衣芽孢杆菌的基因进行诱变。
目标准确、耗时短、见效快
利用分子生物学和基因工程的手段和
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶
α -淀粉酶在地衣芽孢杆菌宿主菌中的分泌表达 （参考 陈敬帮, 周银华, 赵新宇,等. α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的 对比分析[J]. 食品科学, 2015, 36(17):196-200.）
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶
地衣芽孢杆菌(Baci llus Licheniformis) 是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜 热细菌。地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，可调整菌群失调达到治 疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并 具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。 地衣芽孢杆菌(Baci llus Licheniformis)是产生一种具有重要工业生产价值的α淀粉酶的优良菌株。一般自然界中存在的野生型菌株的α-淀粉酶产量很低，如 何提高菌株的产酶性能是普遍关心的问题。目前工业化生产所使用的菌株大多 是以野生菌株为出发菌株经过反复诱变得到的突变株，在实际生产过程中存在 着易污染、生产条件复杂且难以控制等技术性难题。如何有效解决这些问题成 为当前生产淀粉酶制剂工业的关键性问题。
转化子
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶 重组发酵菌株的发酵培养
将重组发酵接种于含四环素 （20 μg/mL）的LB培养基中， 37 ℃、180 r/min培养过夜。再 转接至新鲜的LB培养基中，直 到OD600 nm为1.0时，以1%的 接种量接种到新鲜的淀粉酶发 酵培养基中，37 ℃、180 r/min 振荡培养。
造纸工业
α-淀粉酶在造 纸工业中主要 用来改良纸张 涂层淀粉的黏 度和浓度
α-淀粉酶在工业中的应用
α－淀粉酶在现代工业生产中广泛应用于食品工业、水洗工业、造纸工业、 医药业、饲料业。
疾病检测：黄琛等对乳酸脱氢酶、α- 淀粉
医药业
α-淀粉酶在医 药业中用于疾 病检测、医药 研制等 酶、癌胚抗原进行了联合检测。通过临床试 验证明，将这3种酶进行联合检测，以其中 任意两项为联检阳性，就可以提高卵巢癌的 阳性检出率，弥补各种单项检查在卵巢血清 学诊断中灵敏度较低的不足，并有助于卵巢 癌与卵巢良性肿瘤的鉴别诊断。
α-淀粉酶在食 品工业中应用 广泛，涉及制 糖、冷饮、面 包、啤酒、酒 精工业等多方 面。 淀粉酶应用到到超高麦芽糖浆生产；
冷饮：在制作冷饮的过程中，由于淀粉糊
在低温静置的时候会形成不溶性的硬性凝胶 块，从而导致冷饮的口感不佳。加入α-淀粉 酶能使冷饮黏度降低，流动性增高，保证高 淀粉冷饮的口感，使其更适合于人们的口感。
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶 α-淀粉酶重组表达菌株的构建
接种地衣芽胞杆菌于LB培养 基，37 ℃、180 r/min过夜培养 后，转接至电转化生长培养基 中，250 r/min、37 ℃培养至 OD600 nm为0.8～0.9，冰浴10 min，5 500 r/min离心6 min，收 集菌体，用电转化洗涤培养基 洗涤菌体3 次，重悬于洗涤培养 基中，即为感受态细胞。取感 受态细胞加入5 μL pP43SAT质粒 DNA（50 ng/μL），转至预冷的 电转化杯（0.2 cm）中，冰浴 1～1.5 min，用电脉冲转化仪2.5 kV电击1 次，迅速加900 μL电转 化恢复培养基，37 ℃水浴1 h， 100 r/min恢复培养2 h，涂含有 20 μg /mL的四环素抗性平板， 37 ℃培养20 h，挑取转化子。 地衣芽胞杆菌（LB培养基）
地衣芽孢杆菌制α－淀 粉酶的代谢与调控
1
α-淀粉酶在工业中的应用
2
地衣芽孢杆菌制α-淀粉酶
α-淀粉酶产量的影响因素 α-淀粉酶的研究进展
α-淀粉酶在工业中的应用
α－淀粉酶的系统命名为α－1，4－ 葡聚糖－4－ 葡聚糖水解酶 ( EC 3.2.1.1) ，是重要的工业酶制剂，可以随机切断直链淀粉或支链 淀粉中相邻的α－1，4－ 糖苷键、将淀粉水解为糊精和一系列以葡 萄糖为组成单位的低聚糖。 α － 淀粉酶最早在1811 年由Kirchhoff 发现，它广泛分布于微生 物、植物和动物，但淀粉酶生产菌株主要来源于真菌和细菌，如枯 草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等
3、生长因子对发酵生产的影响
一些微量的生长因子对于产量有着重要的影响。
有些氨基酸如组氨酸、缬氨酸、赖氨酸和酪氨酸对酶的产量起阻碍作用，而半 胱氨酸增加酶产量。 B 族维生素添加到培养基后酶产量也有明显提高，影响最大的是维生素B1和B6。 一些表面活性剂对产量也有一定的影响，如SDS 对产量起促进作用，而其他的 表面活性剂如吐温20、吐温－80 等都对产量起阻碍作用。