一种达托霉素的提取纯化方法

2. 如权利要求1 所述的提取纯化方法，其特征是所述的：
1）、富集:
A、在含有达托霉素的发酵液中投入大孔吸附树脂，吸附后收集树脂，装入解吸柱中；
B、用含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液pH6-7 进行解吸；
C、用含低分子醇浓度高于50% 的水溶液洗脱解吸柱，收集解吸液；
D、解吸液纳滤浓缩；
2）、粗提取：
A、酸性柱层析：调浓缩液pH 至中等酸性；上柱后用40-55% 的低分子醇浓度水溶液阶
梯梯度洗脱；纳滤浓缩；
B、中性柱层析：调浓缩液pH 至中性，向浓缩液中加入1-5% 盐；上柱后用含30-45% 低分
子醇且含1-5% 盐的水溶液洗脱，洗脱量为树脂柱体积的3~4 倍；用20-30% 低分子醇水溶液
洗脱，收集洗脱流分；调pH 至中性；纳滤机浓缩；
3）、精制：
A、中性柱层析：浓缩液中加入1~5% 盐，调整浓缩液pH 中性；上柱后用5% 低分子醇水溶
液洗脱层析柱，洗脱量为柱体积的6-9 倍；用10-20% 低分子醇水溶液洗脱，洗脱量为柱体积
的8-13 倍，收集洗脱流分；收集的流分调pH 至中性；用HPLC 法检测所收集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，纳滤机浓缩；
B、酸性柱层析：调浓缩pH 至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和挥发性酸水溶液组成
的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到8~14 倍
柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；
4）、冻干：
冷冻干燥至粉末后，在20℃ ~30℃，压力低于10Pa 的条件下干燥2~5 小时，得成品。

3. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤1）中的大孔
吸附树脂为HZ818、X-5、HZ804、HZ816 中的任一种；步骤2）的中的层析柱填料为PRP 512、C18、或C8 中的任一种，步骤3）层析柱的填料选用C18 或C8。

4. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征步骤1）中是所述的解吸剂为
甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一种。

5. 如权利要求4 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的解吸剂为乙醇。

6. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的盐为氯化钠、乙酸
铵中的任一种。

7. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤2）A 中的洗脱
为先以40% 的低浓度乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积的2~4 倍；再换成45±2% 的乙醇水溶
液洗脱，用量为柱体积3~5 倍，最后用55% 的乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积3~5 倍。

8. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的酸性层析中上柱液
调pH 的酸为盐酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、甲酸或乙酸中的任一种或几种。

9. 如权利要求8 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的酸为磷酸或甲酸。

10. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的中性柱层析中上
柱液调pH 的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中任一种。

一种达托霉素的提取纯化方法
技术领域
[0001] 本发明属药物化学领域，具体涉及一种达托霉素的提取纯化方法。

[0002]
背景技术
[0003] 达托霉素是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。

它是从小链霉菌
（Streptomyces parvus ）发酵液当中提取得到的十三个氨基酸组成的结构新颖的环脂肽类
抗生素，其中十个氨基酸构成环状结构，在环外癸酸和色氨酸发生酯化。

它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同。

它能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰阳性菌。

达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已呈甲氧西林（methicillin）、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具
强力活性。

[0004] 达托霉素为发酵产物，通过发酵培养得到的发酵滤液，发酵过程中会产生大量的
色素及与达托霉素结构相近似的副产物如脱水达托霉素，因此达托霉素的提取纯化方法较
复杂。

一般达托霉素产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多，导致后提取工作较为复杂，大大地增加了后序的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从而无法产业化生产。

[0005] 对达托霉素后序的提取纯化方法已经有不少文献报导，比如安徽丰原发酵技术工
程研究有限公司申请的《一种高纯达托霉素的制备方法》（申请号200910085837.X），它公开的大致工艺为：发酵液经超滤、纳滤、阳离子树脂吸附酸洗、阴离子树脂中和，纳滤浓缩、结晶。

膜过滤收率达到98 －99％，产品经结晶后纯度也能得到98.5％以上。

但达托霉素是
个两性物质，等电点约是pH4-5，在不同的pH 条件下，它的溶解性是不同的，尤其是达托霉素存在有大量的同系物、异构体，这些杂质在性质上与达托霉素很相似，因此，通过这么简单的工艺，在产业上要分离纯化甚至结晶达托霉素是很困难的。

[0006] 成都雅途生物技术有限公司申请的专利《一种高纯度达托霉素的纯化制备方法》
（申请号200910058577.7），该发明公开了运用一种反相硅胶材料把粗品精制成高纯度的达
托霉素。

该方法仅是达托霉素粗品的精制，而没有公开如何从发酵液制得成品。

[0007] 而达托霉素的原研公司美国卡比斯特制药公司申请的专利《高纯度脂肽、脂肽胶
束及其制备方法》（申请号01805212.6 及其分案200810087401.X）公开了利用阴离子树脂
除去脱水达托霉素和β- 异构，运用改良缓冲液- 尿素洗脱树脂，大致工艺：发酵液经丁醇萃取，用阴离子树脂吸附解吸，疏水相互作用色谱层析，再用阴离子交换色谱法进行反复层析得到高纯度的达托霉素。

整个制备过程涉及的方法较多：萃取、离子交换、色谱层析、纳滤、超滤等，尤其是萃取涉及的溶媒量较多，对生产保护和人身安全均不利。

卡比斯特制药公司另一专利《制备纯化脂肽的方法》（申请号01821937.3），公开了运用结晶的方法来纯化达托霉素，但得到是达托霉素含有钙离子，并非用于制备注射用达托霉素的原料，且其所公开的试验内容均为毫克级，与产业化距离很大，无法直接放大工业生产。

[0008] 文献资料《达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究》（中国抗生素杂志2008 年
2 月第3
3 卷第2 期）介绍了达托霉素发酵液运用大孔树脂富集的方法。

[0009] 这三份文献公开的达托霉素的提取纯化方法都存在操作步骤复杂，发酵液色素和
杂质难去除，最终产品色泽深和纯度不高等问题；而且，不同菌种发酵产生的不同发酵液不一定能用相同的提取方法。

[0010] 因此寻找更有效的脱色方法和更简便的提取纯化方法，才有可能实现达托霉素的
工业化生产。

发明内容
[0011] 本发明的目的是克服现有技术中存在的达托霉素的提取纯化工艺复杂，提纯工艺
难以产业化的缺陷，提供有效方法去除达托霉素中的色素，提高达托霉素的含量，并可适用于工业化大生产的方法。

[0012] 本发明提供了一种达托霉素的提取纯化方法，主要包括富集发酵液中的达托霉
素、富集得到的达托霉素粗提取、达托霉素的精制、冻干几个步骤。

[0013] 其中，粗提取先采用酸性柱层析，再用中性柱层析，这样的工艺操作可以去除发酵
液中存在的大部分的色素，降低部分杂质，如HPLC 图谱中主峰之后（RRT ＞1）和主峰之前（RRT ＜1）的杂质。

其中所述的酸性柱，是指将欲层析的溶液和洗脱剂调至酸性，优选为中
等酸性，如pH 为2 至4 左右；该步有效的降低杂质，提高达托霉素的含量。

中性柱层析是指将欲层析的溶液调至中性，如pH 为6 至8 左右，洗脱剂pH 自然，该步层析对RRT ＞1 的后杂质降低有效。

[0014] 在精制时，采用中性层析和酸性层析来提纯达托霉素，但该阶段的层析主要是降
低或减少粗提取过程中无法降低或去除的杂质。

其中中性柱层析的主要目的是达到去除达
托霉素HPLC 图谱中主峰之后的如脱水达托霉素等杂质（RRT ＞1），酸性柱层析以去除达托
霉素HPLC 图谱中主峰之前的杂质（RRT ＜1），其中所述的中性柱是指将欲层析的溶液调至
中性，如pH 为6 至8 左右；该步层析可以进一步的减少色素，降低杂质脱水达托霉素的含量；酸性柱层析是指将欲层析的溶液和洗脱剂调至酸性，优选为中等酸性，如pH 为2 至4 左右。

[0015] 为了达到更好的提取纯化效果，本发明的提取纯化方法优选：
1）、发酵液中达托霉素的富集:
A、在含有达托霉素的发酵液中投入大孔吸附树脂，吸附后收集树脂，装入解吸柱中；
B、用含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液pH6-7 进行解吸；
C、用含低分子醇浓度高于50% 的水溶液进行解吸，收集解吸液；
D、解吸液纳滤浓缩；
2）、粗提取：
A、酸性柱层析：调浓缩液pH 至中等酸性（pH2-4）；上柱后用40-55% 的低分子醇浓度水
溶液（pH2-4）阶梯梯度洗脱；纳滤浓缩；
B、中性柱层析：调浓缩液pH 至中性，向浓缩液中加入1-5% 盐；上柱后用含30-45% 低分
子醇且含1-5% 盐的水溶液洗脱，洗脱量为树脂柱体积的3~4 倍；用20-30% 低分子醇水溶液
洗脱，收集洗脱流分；调pH 至中性；纳滤浓缩；
3）、精制：
A、中性柱层析：浓缩液中加入1~5% 盐，调整浓缩液pH 中性；上柱后用5% 低分子醇水溶
液洗脱层析柱，洗脱量为柱体积的6-9 倍；用10-20% 低分子醇水溶液洗脱，洗脱量为柱体积
的8-13 倍，收集洗脱流分；调pH 至中性；用HPLC 法检测所收集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，纳滤浓缩；
B、酸性柱层析：调浓缩液pH 至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和挥发性酸水溶液组
成的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到8~14
倍柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；
4）、冻干：
冷冻干燥至粉末后，在20℃ ~30℃，压力低于10Pa 的条件下干燥2~5 小时，得成品。

[0016] 其中，“含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液”，是指水溶液中低分子
醇浓度低于50%，并且中还含有1-5% 盐。

在本申请文件中所提及的类似的水溶液中醇和/
或盐的浓度，均依以上解释。

[0017] 其中所述的步骤1）中的大孔吸附树脂为HZ818、X-5、HZ804、HZ816 中的任一种；
步骤2）的中的层析柱填料为PRP 512、C18、C8 中的任一种，步骤3）层析柱的填料选用C18或C8。

[0018] 其中步骤1）中的解吸剂为为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一种，优选乙醇。

[0019] 其中所述的盐为氯化钠、乙酸铵中的任一种。

[0020] 其中所述的步骤2）A 中的洗脱为先以40% 左右的低浓度乙醇水溶液洗脱，用量为
柱体积的2~4 倍；再换成45% 左右的乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积3~5 倍，最后用55% 左
右的乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积3~5 倍。

洗脱剂可以运用工业级试剂，采用阶梯梯度洗脱。

[0021] 其中所述的步骤2）A 中的收集为从45% 左右的乙醇水溶液洗脱开始。

[0022] 其中酸性层析中上柱液调pH 的酸为盐酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、甲酸或乙酸中
的任一种或几种，优选磷酸或甲酸。

[0023] 其中所述的中性柱层析中上柱液调pH 的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中任一种。

[0024] 更具体地说：
虽然现有技术中也有一些发酵液的富集方法，但其产业化效果不佳。

比如采用“中国
抗生素杂志2008 年2 月第33 卷第2 期”《达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究》中的方法。

此方法中采用动态吸附的方法，工业化生产中发酵液经过板框过滤，滤液上树脂柱吸附，而板框过滤有一部分达托霉素会被菌渣包裹难以滤出，导致板框收率最高也只有85 ～90%，滤液再进行树脂柱吸附过程中滤液逐渐有一些杂质聚集成絮状物会堵住树脂柱，影响
树脂柱解吸的效果，因而整个过程的收率会受影响。

[0025] 本发明对富集的方法进行改良，采用将树脂加入发酵液中进行搅拌吸附试验，减
少板框操作及板框过滤收率的影响，又可以快速将达托霉素从发酵液中进行富集，不至于
树脂柱堵塞。

通过试验，本发明发现吸附滤液中达托霉素的残留量较少，因此发酵结束时，
可以按照10 ～20% 发酵液的量加入树脂，同时加入3% 左右的盐较为合适。

[0026] 在整个生产过程中，收集的解吸液、洗脱流分可经过减压浓缩、纳滤浓缩，优选纳
滤浓缩方法，这种不加热的浓缩方法更适合达托霉素的工业化生产，减少由加热引起的达
托霉素的降解破坏。

[0027] 此外，在步骤1）中通过将树脂直接投入发酵液中搅拌吸附，简化达托霉素的富集
过程，减少由板框过滤过滤带来的损失，增加富集收率。

[0028] 在粗提取和精制过程都采用酸性层析和中性层析是因为pH 不同在层析过程中可
以去除不同的杂质，在两个不同阶段都采用酸性层析和中性层析是为了将杂质尽可能的降
到最低。

[0029] 中性层析的收集液pH 较高，需将pH 调到中性，是因为达托霉素在pH 大于9 的溶
液中很不稳定，会导致达托霉素分解开环，杂质上升。

[0030] 本发明所公开的提取纯化工艺，通过优化提取纯化的各个步骤，使本工艺的生产
成本低，工艺步骤简单，易于工业化生产，同时所得到的达托霉素提取纯化过程中脱色效果
明显，产物纯度高。

[0031]
具体实施方式
[0032] 以下所有实施例中所涉及的达托霉素发酵液以中国专利《一种小链霉菌及其在达
托霉素制备中的应用》（申请号201010225330.2）实施例6 所述的方法制备得到。

[0033] 实施例1 ：达托霉素的富集吸附对比试验:
树脂均为上海华震科技有限公司的大孔吸附树脂HZ818。

[0034] 1）、采用文献资料“中国抗生素杂志2008 年2 月第33 卷第2 期”《达托霉素发酵
液大孔树脂吸附分离的研究》所述的方法，进行试验。

[0035] 树脂预处理：丙酮充分浸泡树脂，除去色素和杂质，用蒸馏水洗涤，至洗涤液加丙
酮不变浑为止。

然后用4 倍树脂体积的1mol/LHCl 溶液浸泡3h，除去碱性物质，蒸馏水洗至中性。

再用4 倍树脂体积的1mol/LNaOH 溶液浸泡3h，除去酸性物质，洗至中性备用。

[0036] 取达托霉素发酵滤液200ml，含达托霉素139mg，已处理好的树脂20ml，湿法装入
玻璃树脂柱（径高比1 ：10），常温下以流速160ml/min 上样，采用动态吸附的方法，吸附时保证树脂吸附饱和或过饱和，并用无盐水以同样流速洗涤树脂柱1h，将树脂间隙未吸附的料
液洗涤下来，合并下柱液及水洗液。

[0037] 经检测：下柱液及水洗液含达托霉素17.24mg，吸附率87.6%。

[0038] 2）、取达托霉素发酵液200ml，含达托霉素139mg，加入如前处理好的树脂20ml，氯
化钠3g，吸附1h，保证树脂吸附饱和或过饱和。

过筛，用氯化钠盐水溶液清洗树脂，合并吸
附余液和盐水洗液。

[0039] 经检测：吸附余液和盐水洗液中含达托霉素13.8 mg，吸附率90.1%。

[0040] 3）、取达托霉素发酵液200ml，含达托霉素139mg，加入如前处理好的树脂40ml，乙
酸铵6g，吸附2h，保证树脂吸附饱和或过饱和。

过筛，用氯化钠盐水溶液清洗树脂，合并吸
附余液和盐水洗液。

[0041] 经检测：吸附余液和盐水洗液中含达托霉素8mg，吸附率94.2%。

[0042]
实施例2、粗提取、精制
1）、粗提取：
A、酸性柱层析：浓缩液40 升，353 克，纯度70％，颜色深棕色，前杂质RRT ＜1 为
11.93%，后杂质RRT ＞1 为17.14%，用甲酸调pH 至2 ；上树脂PRP512 柱后用40%pH 值2.5
的的甲醇浓度水溶液洗脱；收集洗脱流分，调pH 至6，浓缩后20 升，230g，纯度85％，颜色棕色，前杂质RRT ＜ 1 为6.33%，后杂质RRT ＞ 1 为5.24%，收率为65.4％。

[0043] B、中性柱层析：浓缩液20 升，用氢氧化钠调pH 至6 左右，加氯化钠3％左右；上树
脂PRP512 柱后用含20％甲醇洗脱，收集洗脱流分；收集的流分用甲酸调pH 至6 左右；浓缩，
5 升；颜色浅棕色，144g，纯度88％，前杂质RRT ＜1 为5.81%，后杂质RRT ＞1 为2.79%。

[0044] 2）、精制：
A、中性柱层析：浓缩液5 升，纯度88％，浓缩液用甲酸调pH 至6 左右；上C8 柱后，用
10% 甲醇水溶液洗脱，收集洗脱流分；收集的流分用氢氧化钠调pH 至6 ；用HPLC 法检测所收
集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，浓缩，3.5 升；89g，杂质脱水达托
霉素由层析前的2.15% 降至0.51％，除脱水达托霉素外RRT ＞ 1 为0.79%，颜色为黄色。

[0045] B、酸性柱层析：用甲酸调浓缩液pH 至2 左右；上C8 柱后，采用甲醇和甲酸水溶
液组成的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到
8~14 倍柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；浓缩冻干得到
样品，收率70.7％，纯度达到98.5％，RRT ＜ 1 为1.02%，颜色浅黄色。

[0046]
实施例3、粗提取、精制
1）、粗提取：
A、酸性柱层析：浓缩液400 升，3500 克，纯度68.5％，颜色深棕色，前杂质RRT ＜1 为
12.05%，后杂质RRT ＞1 为16.75%，用乙酸调pH 至4 ；上C8 柱后用40% 的pH 值2.7 的乙醇浓度水溶液洗脱；收集洗脱流分，调pH 至8，浓缩后100 升，2180g，纯度83％，颜色棕色，前
杂质RRT ＜ 1 为6.67%，后杂质RRT ＞ 1 为6.85%，收率为62.3％。

[0047] B、中性柱层析：浓缩液100 升，用氢氧化钾调pH 至6 左右，加氯化钠3％左右；上
C8 柱后用含30％甲醇洗脱，收集洗脱流分；收集的洗脱流分用甲酸调pH 至6 左右；浓缩，10升；颜色浅棕色，1405g，纯度90％，前杂质RRT ＜1 为5.52%，后杂质RRT ＞ 1 为3.09%。

[0048] 2）、精制：
A、中性柱层析：浓缩液10 升，纯度90％，浓缩液用甲酸调pH 至8 左右；上C18 柱后，用
10% 乙醇水溶液洗脱，收集洗脱流分；收集洗脱流分用氢氧化钾调pH 至6 ；用HPLC 法检测所
收集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，浓缩，6 升；850g，杂质脱水达
托霉素由层析前的3.09% 降至0.62％，除脱水达托霉素外RRT ＞ 1 为0.51%，颜色为黄色。

[0049] B、酸性柱层析：用甲酸调浓缩液pH 至2 左右；上柱后，采用乙醇和乙酸水溶液组
成的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到8~14
倍柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；浓缩冻干得到样品，
收率67.4％，纯度达到98.2％，RRT ＜ 1 为1.17%，颜色浅黄色。

[0050]
实施例4 ：
1）、发酵液中达托霉素富集:
A、发酵液中达托霉素的吸附：
发酵液5000 L 含达托霉素7600g 搅拌状态下加入150kg 氯化钠和500L（10%）的X-5
树脂，过筛收集树脂，滤液检测：吸附滤液达托霉素400g，吸附率94.7%。

[0051] B、树脂解吸:
收集的树脂，用氯化钠水溶液清洗，清洗后的树脂装入解吸柱中（柱体积1000L）。

[0052] 分别用10% pH 6（磷酸调）乙醇溶液（含5% 氯化钠）1000L 解吸、40% pH 6（磷酸
调）乙醇溶液（含5% 氯化钠）1800L 解吸，流速控制在每小时1/5 倍柱体积。

[0053] C、树脂进一步解吸:
再用51% pH 6（磷酸调）乙醇溶液解吸，流速控制在每小时1/5 倍柱体积。

收集解吸
流分共1950L，约2 倍柱体积，含达托霉素4752g，解吸收率66%。

收集液用磷酸调pH 至6。

[0054] D、纳滤浓缩至450L。

[0055] 2）、富集得到的达托霉素粗提取：
A、酸性柱层析
上柱液配制：边搅拌边向450L 浓缩液中加入磷酸，调pH2。

[0056] 上柱（柱体积300L）：将上述浓缩液上柱吸附，流速控制在每小时1/3 倍柱体积。

[0057] 洗脱：采用阶梯梯度洗脱的方式，洗脱剂pH 用磷酸调2 左右，依次用40% 乙醇溶液
900L、44% 乙醇溶液1200L、46% 乙醇溶液1200L、50% 乙醇溶液洗脱树脂PRP512 柱，流速控制在每小时1/3 倍柱体积。

[0058] 洗脱过程中HPLC 检测，收集效价大于200μg/ml 的流分，收集的洗脱流分共1000L。

纳滤浓缩至150L，含达托霉素3218g，吸附率67.7%。

[0059] B、中柱柱层析
上柱液配制：在树脂PRP512 酸性层析浓缩液中边搅拌边向150L 浓缩液中加入
0.25mol/L 的氢氧化钠调pH 中性，然后再边搅拌边向浓缩液中加入1% 氯化钠。

[0060] 上柱（柱子体积200L）：将上述150L 浓缩液上柱吸附，流速控制在每小时1/3 倍柱
体积。

[0061] 洗脱：采用45% 乙醇溶液450L（含1% 氯化钠）洗脱树脂PRP512 柱，流速4.2L/min。

再用30% 乙醇溶液洗脱树脂PRP512 柱，流速4.3L/min。

洗脱过程中HPLC 检测洗脱流分，
洗至洗脱流分中达托霉素效价低于200μg/ml 后停止洗脱。

收集的洗脱流分用甲酸调pH
至中性。

合并洗脱流分1300L，用纳滤机进行浓缩，浓缩至62L，含达托霉素1995g，吸附率
62.0%。

[0062] 3）、达托霉素的精制：
A、中性柱层析
上柱液配制：上述62L 树脂PRP512 层析浓缩液边搅拌边加入1％氯化钠，同时加入
0.25mol/L 的氢氧化钠溶液，调浓缩液pH 至中性。

[0063] 上柱（柱子体积24L）：浓缩液按柱体积分5 轮上柱吸附，每轮流速控制在2.4L/
min。

[0064] 洗脱：采用5% 乙醇水溶液洗脱C18 柱，流速控制在2.4L/min。

洗脱剂用量为150L
左右。

再更换成10% 乙醇溶液，流速不变，洗脱剂用量为200L 左右，停止洗脱。

洗脱过程中
采用HPLC 法检测来收集的洗脱流分，收集的流分用甲酸调pH 至6.0 左右。

[0065] 合并5 轮中达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，共375L，用纳滤机浓缩
40L，含达托霉素1.2kg，作为后续C18 酸分层析步骤的上柱液使用。

该步收率为60.2％。

[0066] B、酸性柱层析
上柱液配制：上述C18 中性边搅拌边加入甲酸，调pH 至3.0。

[0067] 上柱（柱子体积24L）：浓缩液按柱体积分2 轮上柱，每轮流速控制在2.4L/min。

[0068] 洗脱：采用无水乙醇和甲酸（浓度为0.1%）组成混合洗脱剂按下列线性梯度洗脱，
洗脱流速为2.4L/min。

[0069] 洗脱梯度时间程序表见下表
洗脱过程中，在洗脱剂用量达到约72L 开始收集流分；在洗脱剂用量达到约192L 时停
止洗脱。

[0070] 采用HPLC 法检测收集的流分，合并2 轮中达托霉素归一化含量大于等于95% 的
160L 流分作为纯组分进入后续工序。

[0071] 4）、冻干：
采用冷冻干燥机对上述浓缩液进行冻干，冷冻干燥至粉末后，在20℃，并在压力为
10Pa 的条件下冻干2 小时，得成品780g。

[0072] 最后成品的纯度97.4%，收率65.0%。

[0073]
实施例5 ：
1）、发酵液中达托霉素富集:
A、发酵液中达托霉素的吸附：
发酵液4500 L 含达托霉素8267g 加入150kg 氯化钠和500L（11%）的HZ816 树脂搅拌
2h，检测：吸附滤液达托霉素的效价93μg/ml，滤液余量中达托霉素419g，吸附率94.9%。

[0074] B、达托霉素的解吸:
过筛收集树脂，用氯化钠水溶液清洗，清洗后的树脂装入解吸柱中（柱体积1000L）。

[0075] 解吸时，分别用12% pH 7（盐酸调）甲醇溶液（含1% 乙酸铵）500L 解吸、41% pH 7（盐酸调）甲醇溶液（含1% 乙酸铵）1000L 解吸。

流速控制在每小时1/2 倍柱体积。

[0076] C、达托霉素进一步解吸:
之后再用53% pH7（盐酸调）甲醇溶液解吸，流速控制在每小时1/2 倍柱体积。

收集解
吸液共2600L，约2 倍柱体积，含达托霉素5016g，解吸收率63.9%。

收集液用盐酸调pH 至
6.5。

[0077] D、纳滤浓缩至500L。

[0078]
2）、富集得到的达托霉素粗提取：
A、酸性柱层析
上柱液配制：边搅拌边向500L 浓缩液中加入盐酸，调pH4。

[0079] 上柱（柱体积300L）：将上述浓缩液上柱吸附，流速控制在每小时1 倍柱体积。

[0080] 洗脱：采用阶梯梯度洗脱的方式，洗脱剂pH 用盐酸调4 左右，依次用42% 乙醇溶液900L、45% 乙醇溶液1200L、47% 乙醇溶液1200L（开始收集）、55% 乙醇溶液洗脱树脂PRP 512柱，流速控制在每小时1/3 倍柱体积。

[0081] 洗脱过程中HPLC 检测，收集效价大于200μg/ml 的流分，收集的洗脱流分共1500L。

纳滤浓缩至90L，含达托霉素3044g，吸附率60.6%。

[0082] B、中柱柱层析
上柱液配制：在树脂PRP512 酸性层析浓缩液中边搅拌边向150L 浓缩液中加入
0.25mol/L 的氢氧化钠调pH 中性，然后再加入5% 氯化钠。

[0083] 上柱（柱子体积200L）：将上述90L 浓缩液上柱吸附，流速控制在每小时1 倍柱体
积。

[0084] 洗脱：采用40% 乙醇溶液800L（含1% 氯化钠）洗脱树脂PRP 512 柱，流速4.4L/
min。

再用30% 乙醇溶液洗脱树脂PRP512 柱，流速5.3L/min。

洗脱过程中HPLC 检测洗脱流分，洗至洗脱流分中达托霉素效价低于200μg/ml 后停止洗脱。

收集的洗脱流分用乙酸调
pH 至中性。

合并洗脱流分1400L，用纳滤机进行浓缩，浓缩至71L，含达托霉素1825g，吸附
率60.0%。

[0085] 3）、达托霉素的精制：
A、中性柱层析
上柱液配制：上述71L 树脂PRP512 层析浓缩液边搅拌边加入5％氯化钠，同时加入
0.25mol/L 的氢氧化钠溶液，调浓缩液pH 至中性。

[0086] 上柱（柱子体积24L）：上柱液按柱体积分5 轮上柱吸附，每轮流速控制在2.4L/
min。

[0087] 洗脱：采用5% 乙醇水溶液洗脱C8 柱，流速控制在2.4L/min。

洗脱剂用量为约
210L。

[0088] 更换成11% 乙醇溶液，流速不变，洗脱剂用量为约300L 左右，停止洗脱。

洗脱过程
中按流分收集，收集的流分用乙酸调pH 至6.5 左右。

[0089] 采用HPLC 法检测所收集的流分，合并5 轮中达托霉素归一化含量大于等于92% 的
流分，共560L，用纳滤机浓缩40L，含达托霉素1.19kg，作为后续C18 酸分层析步骤的上柱液
使用。

该步收率为65.3％。

[0090] B、酸性柱层析
上柱液准备：上述C18 中性边搅拌边加入乙酸，调pH 至3.0。

分2 轮上柱（柱子体积
24L）吸附层析，流速控制在2.4L/min。

[0091] 采用无水乙醇和乙酸（浓度为0.1%）组成混合洗脱剂按下列线性梯度洗脱，洗脱流
速为2.4L/min。

[0092] 洗脱梯度时间程序表见下表
洗脱过程中，在洗脱剂用量达到约144L 开始收集流分；在洗脱剂用量达到约336L 时停
止洗脱。

[0093] 采用HPLC 法检测收集的流分，合并2 轮中达托霉素归一化含量大于等于95% 的
160L 流分作为纯组分进入后续工序。

[0094] 4）、冻干：
采用冷冻干燥机对上述浓缩液进行冻干，冷冻干燥至粉末后，在30℃，并在压力为8Pa
的条件下冻干5 小时，得成品774g。

[0095] 最后成品的纯度97.8%，收率65.0%。

[0096]
实施例6 ：对比试验：
采用申请号018052126 说明书中实施例4 的方法所进行的提纯试验
以微孔过滤的方法使发酵液澄清，调pH4.5 和pH6.5，使达托霉素在正丁醇和水之间进
行萃取和反萃取，按照us4874843 的提取方法上HP －20 柱，依次用乙腈：水＝95 ：5，85 ：15，60 ：40 的梯度洗脱，可提高达托霉素的纯度至91％，收率60％，再将此达托霉素加到含
有6M 尿素的pH7.0 醋酸盐缓冲液的Poros D50 阴离子交换树脂上，用0 －1000mM 的NaCl
梯度洗脱，大约在300mMNaCl 从树脂上洗脱纯化的达托霉素，纯度为98％。