一种达托霉素的提取纯化方法

2. 如权利要求1 所述的提取纯化方法，其特征是所述的：

1）、富集:

A、在含有达托霉素的发酵液中投入大孔吸附树脂，吸附后收集树脂，装入解吸柱中；

B、用含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液pH6-7 进行解吸；

C、用含低分子醇浓度高于50% 的水溶液洗脱解吸柱，收集解吸液；

D、解吸液纳滤浓缩；

2）、粗提取：

A、酸性柱层析：调浓缩液pH 至中等酸性；上柱后用40-55% 的低分子醇浓度水溶液阶

梯梯度洗脱；纳滤浓缩；

B、中性柱层析：调浓缩液pH 至中性，向浓缩液中加入1-5% 盐；上柱后用含30-45% 低分

子醇且含1-5% 盐的水溶液洗脱，洗脱量为树脂柱体积的3~4 倍；用20-30% 低分子醇水溶液

洗脱，收集洗脱流分；调pH 至中性；纳滤机浓缩；

3）、精制：

A、中性柱层析：浓缩液中加入1~5% 盐，调整浓缩液pH 中性；上柱后用5% 低分子醇水溶

液洗脱层析柱，洗脱量为柱体积的6-9 倍；用10-20% 低分子醇水溶液洗脱，洗脱量为柱体积

的8-13 倍，收集洗脱流分；收集的流分调pH 至中性；用HPLC 法检测所收集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，纳滤机浓缩；

B、酸性柱层析：调浓缩pH 至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和挥发性酸水溶液组成

的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到8~14 倍

柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；

4）、冻干：

冷冻干燥至粉末后，在20℃ ~30℃，压力低于10Pa 的条件下干燥2~5 小时，得成品。

3. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤1）中的大孔

吸附树脂为HZ818、X-5、HZ804、HZ816 中的任一种；步骤2）的中的层析柱填料为PRP 512、C18、或C8 中的任一种，步骤3）层析柱的填料选用C18 或C8。

4. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征步骤1）中是所述的解吸剂为

甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一种。

5. 如权利要求4 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的解吸剂为乙醇。

6. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的盐为氯化钠、乙酸

铵中的任一种。

7. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤2）A 中的洗脱

为先以40% 的低浓度乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积的2~4 倍；再换成45±2% 的乙醇水溶

液洗脱，用量为柱体积3~5 倍，最后用55% 的乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积3~5 倍。

8. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的酸性层析中上柱液

调pH 的酸为盐酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、甲酸或乙酸中的任一种或几种。

9. 如权利要求8 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的酸为磷酸或甲酸。

10. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的中性柱层析中上

柱液调pH 的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中任一种。

一种达托霉素的提取纯化方法

技术领域

[0001] 本发明属药物化学领域，具体涉及一种达托霉素的提取纯化方法。

[0002]

背景技术

[0003] 达托霉素是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。它是从小链霉菌

（Streptomyces parvus ）发酵液当中提取得到的十三个氨基酸组成的结构新颖的环脂肽类

抗生素，其中十个氨基酸构成环状结构，在环外癸酸和色氨酸发生酯化。它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同。它能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰阳性菌。达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已呈甲氧西林（methicillin）、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具

强力活性。

[0004] 达托霉素为发酵产物，通过发酵培养得到的发酵滤液，发酵过程中会产生大量的

色素及与达托霉素结构相近似的副产物如脱水达托霉素，因此达托霉素的提取纯化方法较

复杂。一般达托霉素产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多，导致后提取工作较为复杂，大大地增加了后序的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从而无法产业化生产。

[0005] 对达托霉素后序的提取纯化方法已经有不少文献报导，比如安徽丰原发酵技术工

程研究有限公司申请的《一种高纯达托霉素的制备方法》（申请号200910085837.X），它公开的大致工艺为：发酵液经超滤、纳滤、阳离子树脂吸附酸洗、阴离子树脂中和，纳滤浓缩、结晶。膜过滤收率达到98 －99％，产品经结晶后纯度也能得到98.5％以上。但达托霉素是

个两性物质，等电点约是pH4-5，在不同的pH 条件下，它的溶解性是不同的，尤其是达托霉素存在有大量的同系物、异构体，这些杂质在性质上与达托霉素很相似，因此，通过这么简单的工艺，在产业上要分离纯化甚至结晶达托霉素是很困难的。

[0006] 成都雅途生物技术有限公司申请的专利《一种高纯度达托霉素的纯化制备方法》

（申请号200910058577.7），该发明公开了运用一种反相硅胶材料把粗品精制成高纯度的达

托霉素。该方法仅是达托霉素粗品的精制，而没有公开如何从发酵液制得成品。

[0007] 而达托霉素的原研公司美国卡比斯特制药公司申请的专利《高纯度脂肽、脂肽胶

束及其制备方法》（申请号01805212.6 及其分案200810087401.X）公开了利用阴离子树脂

除去脱水达托霉素和β- 异构，运用改良缓冲液- 尿素洗脱树脂，大致工艺：发酵液经丁醇萃取，用阴离子树脂吸附解吸，疏水相互作用色谱层析，再用阴离子交换色谱法进行反复层析得到高纯度的达托霉素。整个制备过程涉及的方法较多：萃取、离子交换、色谱层析、纳滤、超滤等，尤其是萃取涉及的溶媒量较多，对生产保护和人身安全均不利。卡比斯特制药公司另一专利《制备纯化脂肽的方法》（申请号01821937.3），公开了运用结晶的方法来纯化达托霉素，但得到是达托霉素含有钙离子，并非用于制备注射用达托霉素的原料，且其所公开的试验内容均为毫克级，与产业化距离很大，无法直接放大工业生产。

[0008] 文献资料《达托霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究》（中国抗生素杂志2008 年

2 月第3

3 卷第2 期）介绍了达托霉素发酵液运用大孔树脂富集的方法。

[0009] 这三份文献公开的达托霉素的提取纯化方法都存在操作步骤复杂，发酵液色素和

杂质难去除，最终产品色泽深和纯度不高等问题；而且，不同菌种发酵产生的不同发酵液不一定能用相同的提取方法。

[0010] 因此寻找更有效的脱色方法和更简便的提取纯化方法，才有可能实现达托霉素的

工业化生产。

发明内容

[0011] 本发明的目的是克服现有技术中存在的达托霉素的提取纯化工艺复杂，提纯工艺

难以产业化的缺陷，提供有效方法去除达托霉素中的色素，提高达托霉素的含量，并可适用于工业化大生产的方法。

[0012] 本发明提供了一种达托霉素的提取纯化方法，主要包括富集发酵液中的达托霉

素、富集得到的达托霉素粗提取、达托霉素的精制、冻干几个步骤。

[0013] 其中，粗提取先采用酸性柱层析，再用中性柱层析，这样的工艺操作可以去除发酵