克隆载体

N
cI Cro
Q
S
R
激活 tL PL tR2 N 后期 P'R tM Pi 溶源性建立 和保持 PM OL OR tR1 后早期
PE CI阻遏物
2) λ噬菌体基因的表达
i. 最早期转录：转录起始于CI基因两侧的PL和PR启动子， 止于N和Cro末端的tL和tR1，有的右向转录物可継续通 过O和P止于tR2。 ii. 后早期转录：N蛋白可使宿主细胞转录终止因子ρ失活， 导致转录通过tR1、tR2和tL进入其余早期基因区域。 iii. 后期转录：cro蛋白可与OL和OR结合，阻止RNA聚合 酶与PL和PR结合，转录终止，此时已合成了足够多的 控制蛋白Q，它对P'R起激活作用，导致后期基因转录。 iv. DNA复制：因早期转录获DNA复制蛋白O和P，双向 复制开始。 v. 包装：Nul和A蛋白与λDNA的cos位点的识别与切割， FI蛋白促进DNA进入头部蛋白，DNA充满后，gpw和 gpFⅡ将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
E.coli
px
5）λDNA作载体的缺点和解决办法
i.λ头部只能容纳自身DNA的78-105%，即39-52.5 Kb， 天然λ仅可插入3 Kb外源DNA片段—除去所有与λ裂解 无关的基因和空白区，最大可插入22 Kb。 ii.同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插 入—体内突变和建立新的克隆位点。 ⅲ.重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—利用体外 包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。
ⅰ.多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列 顺序相同，但方向相反。 这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入 ⅱ.产生不同末端规律排列: 两端限制酶位点产生5’—突起 端（EcoRI和HindⅢ），与之相邻的两个限制酶位点产 生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限 制酶位点产生5’—突起端或平端。这种排列方式十分有 利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。
λ DNA的包装
左端 Nu1 A W B C Nu3 D E FI FII 头-尾 gpB 连接器 gpc.E gp Nu3 gp gro EL gpNu3 gp gro ES gpc 末端酶 gpA gpNu1 复合物I λ DNA E.coli INF Or THF gpD gpFII gpw 复合物II (F1可促进 该复合物形成） 扩张 gpE
1. 噬菌体λ载体
1）λ的结构和特点
i. 一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t 5‘-突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）该末端称为cos 位点，可被λ编码的末端酶所识别（该酶由λ末端的两 个基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成） ii. 基因结构—46个基因，分为以下四类： ⅰ) 调控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ—决定进入溶 源化还是裂解状态 ⅱ) DNA复制：O、P、Q ⅲ)λ重组：int、xis、redβ和gam ⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S & R （细胞裂解）λ中部约1/3的DNA(b2)与λ存活无关。
质粒DNA的转移和复制
5' 3' 3'5'
2）质粒转移的必备条件 ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺 式 作用（cis-action） ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用 ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用 3）质粒转移类型 ⅰ.自我转移（Self-transmissible） ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若 无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可 提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。 ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只 有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具 备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上， 该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种 细胞的频率。
3.质粒DNA的转移
1）质粒DNA的转移过程
质粒的自主转移过程
donor cell Recipient cell
+
nick-ligation at oriT
+
繖毛结合 性繖毛-细胞壁接触 donor cell
3)分离 2)tro基因表达 1)重新环化
性繖毛收缩
细胞壁接触 不稳定接合对 DNA转移 traT 供体接合 DNA合成 稳定化
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
外源DNA 取代 导入 λ
-
P2
滚环复制
7) λ载体的遗传标记基因和重组子筛选
由于λ载体或重组DNA是通过感染途径进入宿主细胞的， 因而形成的噬菌斑就是一个明显的标记。用于重组子检测的 遗传标记基因主要有lacZ 基因。不管是用插入或取代法，该 标记基因均会失活。 利用spi-选择重组子：野生型λ不能在P2溶源化菌种中成活， 称之为spi+(sensitive to P2 interference)，这与red和gam基因 有关。若用外源DNA将这些基因取代，形成的重组DNA分子 可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。λ载体λ1059、λL47.1 均属此类，这种选择方式亦称之为显性选择。
拷贝数
15-20 500-700 10-12 25 15-20
2) 质粒载体常用的遗传标记基因
Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZα
3) 多克隆位点区
大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的
6.实例—pUC18和pUC19
pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个 显著特点： 1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大 2）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα 3）多克隆位点区
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺 失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase） 不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又 例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)： 假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’-末 端或5’-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子）， 显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
左臂
隔离段 E lac5 XbE bio256 E KH54
右臂
50kb
nin5 QSR80
大肠杆菌λ载体 Charon 4A
限制酶 克隆方式： EcoRI 取代法
E 20.1kb
E 7.1kb
Xb Xb XbI 插入法 5.64 0
red gam P2 λ +
red gam 导入
λ
无噬菌斑
Spi 重组子的筛选
大肠杆菌λ噬菌体的基因和表达调控
头
A w B C D E ZU V G T
尾
H M L K I J N O P Q SR
整合 切除、重组 att PI O P tL 免疫和调控 OL tM PM OR PR tR1 Ori TR2 DNA合成 宿主裂解 PR
PL
int
exo
kil cIII rel
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
Biblioteka Baidu
重组
R
+
DNA 转移
R
+ R
4.质粒DNA的复制和调节控制
1) 复制机制—复制方向、终止和方式 2) 质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需 高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同 一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。 3) 质粒的复制调控机制 例子: ColE1质粒的复制及复制起点结构 Boros etal.(1984)分离到一个pBR322突变体， 其拷贝数可达1000/ cell或65%总DNA，原因是在 RNAI基因的3'端附近发生一次G→T颠换。
-555bp
RNA II(primase)
ori
RNaseH
质粒DNA的 复制过程
ColE1质粒 复制起点结构
5.大肠杆菌质粒载体
1) 常用质粒载体的复制子
质粒载体
pBR322系列 pUC系列 pACYC系列 pSC101系列 colE1
复制子来源
pMB1 pMB1 p15A pSC101 colE1
3) λDNA的复制
细胞外 细胞内
4) λDNA的包装过程
l 头—尾连接器由12分子gpB构成中空结构，groE1和groES 负责装配 l pX由10个杂合的gpC和gpE构成，使连接器定位 l gpW和gpFⅡ结合在连接器上，防止DNA外泄，提供尾部 粘着点末端酶由两基因产物组成（Nul和A），gpNul2-gpA1 (20,444 x 2 + 72,280 = 113,168) 该酶具有以下多种酶活性：1）特异DNA位点结合；2）特异 位点切口形成；3）头前体结合；4）gpFI结合；5）cos位点 变性；6）DNA转位；7）DNA序列扫描；8）ATP结合；9） ATP水解。 因此，头部蛋白gpE和gpD以及包装蛋白gpA是λ DNA形成 噬菌体颗粒必不可少的组分，体外包装物的制备就是依据这 一结论
pUC18和pUC19载体
pUC18
HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI
EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
pUC19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
vi. 裂解：基因R和S产物形成，细菌细胞裂解，噬菌体颗 粒释放。 vii. 溶源反应：CⅡ和CⅢ基因产物分别激活PE和PI的左向 转录，致使CI和int基因表达，CI 产物可阻止早期转录， 导致后期基因表达受阻。 对于裂解反应和溶源反应的选择，取决于感染细胞中 一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。 * 当λDNA注入宿主细胞后，线状DNA首先环化为环状 DNA，这种环化有以下几点好处： a. 若为单向复制，不管从何处开始复制，全基因组均 可全部复制 b. 噬菌体DNA插入宿主染色体DNA，只需一次位点 特异性重组 c. 拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋 d. 受损的基因组增大了存活的可能性，因为双向复 制不会受阻于 损伤的DNA链，而单向复制就不能通过