实验室检测常用技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
病原学检测： 聚合酶链式反应
基本概念
抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免 疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴细胞，并在体内外 与之特异性结合，发生免疫反应的物质。
抗体：是能与相应的抗原特异性结合的蛋白质分子， 和机体其他生物大分子一样是细胞的产物，分泌到体 液中或表现在细胞表面上。
抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清 学反应。
张雅为 辽宁省疫控中心 2010年11月
《国家动物疫情测报体系管理规范》
猪：口蹄疫、猪水泡病、猪瘟、伪狂犬病、猪呼吸与 繁殖障碍综合征
牛：口蹄疫、结核、布氏杆菌病、疯牛病 羊：口蹄疫、布氏杆菌病、山羊/绵羊痘、痒病 马属动物：马传贫、马鼻疽 鸡：新城疫、禽流感 鸭、鹅：禽流感
内容
血清学检测： 血凝抑制试验 凝集试验 补体结合试验 皮内变态反应 联免疫吸附试验
轻轻混匀，静置约40分钟。
结果判定
以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI 滴度。
只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血 清误差不超过1个滴度，实验结果才有效。
HI价小于等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2 为可疑，需重复试验；HI价大于等于5log2为阳性。 （GB/T 18936-2003）
试验原理（续）
血凝抑制试验可以用于：①应用标准病毒悬液测定血 清中的相应抗体；②应用特异性抗体鉴定新分离的病 毒。
测定动物血清中的血凝抑制抗体，必须首先：①滴定 病毒或其血凝素对相应红细胞的血凝效价；②应用某 种或某几种方法处理被检血清，除去其中的非特异性 血凝抑制物质。
实验准备
血凝板 0.5%-1%的红细胞悬液 100ul微量移液器 PBS或生理盐水 待检病毒液或检测抗原 待检血清及阳性血清
试管法
每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照。
牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异 是第一管加1.2ml稀释液和0.05ml被检血清。
大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、 骆驼用1:50和1:100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50 。
试管法
结果判定
参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读
牛、马、鹿、骆驼 1:50血清稀释，猪、山羊 、绵羊和狗1:25血清稀释，出现“++”以上凝集 现象时，受检血清判定为可疑。 （GB/T 186462002）
血凝实验步骤
抗原（ul）
注：第12孔为阴性对照。
振荡混匀，于室温（20℃-25 ℃ ）放置40分钟后判定 结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔 红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。
结果判定
将板倾斜，观察红细胞有无成泪滴状流淌。完全血凝 （不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝 单位（HAU）。
四单位抗原配置
根据血凝试验结果配置4HAU抗原。以完全血凝的病 毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含 4HAU抗原的稀释倍数。如血凝终点滴度为1：256， 则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256/4）。
四单位抗原配置
四单位抗原回滴
4单位抗原(µl)
血凝抑制试验步骤
注：第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。
血凝及血凝抑制试验
试验原理
某些病毒或病毒的血凝素，能选择性的使某种或某几 种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称 为血凝（hemagglutination，HA），也称直接血凝反 应。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量 足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受 体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细 胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 （hemagglutination ingibition，HI）反应，也称血凝 抑制反应。
1）++++菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮； 2）+++菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮； 3）++菌体凝集显著，液体50%清亮； 4）+凝集物有沉淀，液体25%清亮； 5）-凝集物无沉淀，液体均匀浑浊。
试管法
结果判定
牛、马、鹿、骆驼 1:100血清稀释，猪、山 羊、绵羊和狗1:50血清稀释，出现“++”以上凝 集现象时，受检血清判定为阳性。
பைடு நூலகம்
直接凝集试验
颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象的试验 称作直接凝集试验（direct agglutination test）。
直接凝集试验按操作方法可分为玻片法和试管法。
玻片法
玻片法为定性试验。 此法简便快速，可用已知诊断抗原悬液检测待检血清
是否存在相应抗体。
玻片法
试验准备：
抗原、标准阳性血清、阴性血清 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血、 无腐败气味 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格 吸管或分装器，适于滴加0.03mL 牙签或火柴杆，供搅拌用
玻片法
操作方法：
将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相 应血清0.03ml
在受检血清旁滴加抗原0.03ml 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合 每次试验应设阴、阳性血清对照
玻片法
判定：
在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对 被检血清进行判定。
受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者 判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者 判为阴性（-）。（GB/T 18646-2002）
试管法
材料准备：
稀释液：0.5%石碳酸生理盐水。检验羊血清时 用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，如果血清稀释用 含0.5%石碳酸的10%盐溶液，抗原的稀释也用含 0.5%石碳酸的10%盐溶液
抗原、阳性血清和阴性血清 凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱
试管法
置37℃～40 ℃温箱24h，取出检查并记录结果。
凝集实验
概述
细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在胶乳、白陶土 、离子交换树脂和红细胞的抗原，与相应抗体结合， 在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可 见的凝集团块，称为凝集试验（agglutination）。
凝集试验可用于检测抗原或抗体，最突出的优点是操 作简便。
凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝 集试验（简称凝集试验）和间接凝集试验。
基本概念
抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免 疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴细胞，并在体内外 与之特异性结合，发生免疫反应的物质。
抗体：是能与相应的抗原特异性结合的蛋白质分子， 和机体其他生物大分子一样是细胞的产物，分泌到体 液中或表现在细胞表面上。
抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清 学反应。
张雅为 辽宁省疫控中心 2010年11月
《国家动物疫情测报体系管理规范》
猪：口蹄疫、猪水泡病、猪瘟、伪狂犬病、猪呼吸与 繁殖障碍综合征
牛：口蹄疫、结核、布氏杆菌病、疯牛病 羊：口蹄疫、布氏杆菌病、山羊/绵羊痘、痒病 马属动物：马传贫、马鼻疽 鸡：新城疫、禽流感 鸭、鹅：禽流感
内容
血清学检测： 血凝抑制试验 凝集试验 补体结合试验 皮内变态反应 联免疫吸附试验
轻轻混匀，静置约40分钟。
结果判定
以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI 滴度。
只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血 清误差不超过1个滴度，实验结果才有效。
HI价小于等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2 为可疑，需重复试验；HI价大于等于5log2为阳性。 （GB/T 18936-2003）
试验原理（续）
血凝抑制试验可以用于：①应用标准病毒悬液测定血 清中的相应抗体；②应用特异性抗体鉴定新分离的病 毒。
测定动物血清中的血凝抑制抗体，必须首先：①滴定 病毒或其血凝素对相应红细胞的血凝效价；②应用某 种或某几种方法处理被检血清，除去其中的非特异性 血凝抑制物质。
实验准备
血凝板 0.5%-1%的红细胞悬液 100ul微量移液器 PBS或生理盐水 待检病毒液或检测抗原 待检血清及阳性血清
试管法
每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照。
牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异 是第一管加1.2ml稀释液和0.05ml被检血清。
大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、 骆驼用1:50和1:100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50 。
试管法
结果判定
参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读
牛、马、鹿、骆驼 1:50血清稀释，猪、山羊 、绵羊和狗1:25血清稀释，出现“++”以上凝集 现象时，受检血清判定为可疑。 （GB/T 186462002）
血凝实验步骤
抗原（ul）
注：第12孔为阴性对照。
振荡混匀，于室温（20℃-25 ℃ ）放置40分钟后判定 结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。对照孔 红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。
结果判定
将板倾斜，观察红细胞有无成泪滴状流淌。完全血凝 （不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝 单位（HAU）。
四单位抗原配置
根据血凝试验结果配置4HAU抗原。以完全血凝的病 毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含 4HAU抗原的稀释倍数。如血凝终点滴度为1：256， 则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256/4）。
四单位抗原配置
四单位抗原回滴
4单位抗原(µl)
血凝抑制试验步骤
注：第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。
血凝及血凝抑制试验
试验原理
某些病毒或病毒的血凝素，能选择性的使某种或某几 种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称 为血凝（hemagglutination，HA），也称直接血凝反 应。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量 足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受 体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细 胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 （hemagglutination ingibition，HI）反应，也称血凝 抑制反应。
1）++++菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮； 2）+++菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮； 3）++菌体凝集显著，液体50%清亮； 4）+凝集物有沉淀，液体25%清亮； 5）-凝集物无沉淀，液体均匀浑浊。
试管法
结果判定
牛、马、鹿、骆驼 1:100血清稀释，猪、山 羊、绵羊和狗1:50血清稀释，出现“++”以上凝 集现象时，受检血清判定为阳性。
பைடு நூலகம்
直接凝集试验
颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象的试验 称作直接凝集试验（direct agglutination test）。
直接凝集试验按操作方法可分为玻片法和试管法。
玻片法
玻片法为定性试验。 此法简便快速，可用已知诊断抗原悬液检测待检血清
是否存在相应抗体。
玻片法
试验准备：
抗原、标准阳性血清、阴性血清 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血、 无腐败气味 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格 吸管或分装器，适于滴加0.03mL 牙签或火柴杆，供搅拌用
玻片法
操作方法：
将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相 应血清0.03ml
在受检血清旁滴加抗原0.03ml 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合 每次试验应设阴、阳性血清对照
玻片法
判定：
在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对 被检血清进行判定。
受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者 判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者 判为阴性（-）。（GB/T 18646-2002）
试管法
材料准备：
稀释液：0.5%石碳酸生理盐水。检验羊血清时 用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，如果血清稀释用 含0.5%石碳酸的10%盐溶液，抗原的稀释也用含 0.5%石碳酸的10%盐溶液
抗原、阳性血清和阴性血清 凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱
试管法
置37℃～40 ℃温箱24h，取出检查并记录结果。
凝集实验
概述
细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在胶乳、白陶土 、离子交换树脂和红细胞的抗原，与相应抗体结合， 在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可 见的凝集团块，称为凝集试验（agglutination）。
凝集试验可用于检测抗原或抗体，最突出的优点是操 作简便。
凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝 集试验（简称凝集试验）和间接凝集试验。