鼠单克隆抗体人源化

细胞与分子免疫学杂志 1997;13(1):68-72

Journal of Cellular and Molecular Immunology

鼠单克隆抗体人源化

袁清安俞炜源黄翠芬

(军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071)

提要鼠源性单克隆抗体应用于临床由于HAMA反应的存在而受到阻碍。以CDR 移植为核心,以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服HAMA 反应的主要手段。本文结合单克隆抗体人源化的最新进展对该领域的工作作一综述。

关键词人源化 CDR移植分子模建 HAMA 单克隆抗体

抗体是免疫系统中最重要的分子,在临床上有极大的应用价值。其立体结构组成

与功能关系表明，不同的结构模块(CH1、CH2、CH3、V

L 、V

H

)在空间和折叠上相对

独立,对应着不同的功能。抗体的效应功能由Fc引发，特异性和高亲和性由Fv 决定。大量的抗体一级结构序列和越来越多的抗体立体结构数据分析表明,Fv在空间结构上十分保守,但人、鼠间有差异的框架区(FR)、空间构象及序列各由有差别的6个互补决定区(CDR)组成。CDR上有直接的抗原接触位点,FR是Fv最主要的抗原性决定区,是引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的主要部分,在异种间可引起抗个体型抗体。

1 鼠源单克隆抗体的临床应用与问题

以细胞融合为基础的鼠杂交瘤技术的发展，使得人们能够大量获取高亲和性和强特异性的鼠单克隆抗体(McAb),它们在临床上有多方面的潜在应用[1]。

1.1 感染性疾病抗体提供的被动免疫,消除了病原体的致病能力: 仅仅是Fab 与抗原的结合，足以中和很多毒素与病毒的毒力；Fc与相应受体结合，可引发包括ADCC在内的诸多效应功能。

1.2 体内定位诊断同位素标记的McAb或Fab在病灶的定位造影,对确诊及手术有很大帮助,已用于心血管、原发癌及转移癌等疾病的定位诊断。

1.3 免疫调节在免疫活化方面,双特异性的抗体将效应细胞表面的信号转导分子和病变细胞表面的抗原分子交联,便可活化效应细胞,使之发挥免疫功能；在免疫抑制方面,抗受体抗体可封闭受体,阻断效应细胞活化的路径。因受体分子的分

布而引起普遍性的或选择性的免疫抑制,在移植排斥和自身免疫等疾病的治疗上有广阔的前景。

1.4 肿瘤治疗肿瘤特异抗原或相关抗原的抗体可作为导向分子,将效应细胞(如Tc)和免疫活化因子(如IL-2)富集于肿瘤组织周围,发挥它们的杀伤作用；小分子抗体导向的免疫毒素可渗透到实体肿瘤中,对癌细胞进行有效杀伤；自分泌生长型的肿瘤可用抗生长因子抗体或抗受体抗体进行竞争抑制,减缓肿瘤的生长。

McAb在临床上还有其他方面的应用,有待于进一步的开发。其中很有意义的是血栓病的治疗。将抗血小板抗体或抗纤维蛋白抗体与溶栓活性分子偶联或融合,作成用量少、见效快的新型溶栓导向药物,已有多种应用于临床试验。

不幸的是McAb应用于人体存在着严重的缺陷[2]: 血清中半寿期短；仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能；最大的障碍是诱发HAMA反应。McAb诱导的内源性抗体基本上可分两类[1]:抗个体型(anti-idiotype)和抗同种型(anti-isotype)。前者通过中和抗原结合位点而消除了McAb的能力;后者除了加速McAb的清除外,还会在诊断时引起假阳性,还可能引起过敏性休克。除非这些问题被解决,大剂量及多次给病人使用McAb是不可能的。目前克服这一困难的首选途径是鼠McAb

的人源化。

2 鼠McAb人源化的原则和策略

使用人源抗体或人源化抗体是克服HAMA反应的两种可能的方法。由于特异性强、亲和力高的人源抗体的基因不易得到,目前主要进行鼠McAb的人源化。鼠McAb 的人源化,就是为克服鼠源McAb的免疫原性而将其进行改造,使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓(profile),从而逃避人免疫系统的识别,避免诱导HAMA反应。进行抗体的人源化有两个基本原则:保持或提高抗体的亲和力和特异性;大大降低或基本消除抗体的免疫原性。人源化有多种方案,都必须遵循这两个原则,尤其不能丧失抗体特异结合的能力。

第一代人源化抗体是将鼠McAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体。由于这两部分在空间结构上相对独立,其独特的抗原亲和力保持得很好,但因为有鼠McAb可变区的存在,应用时仍有强烈的HAMA反应。

在此基础上，进一步将鼠McAb可变区中相对保守的FR换成人的FR,仅仅保留抗原结合部位CDR(即CDR移植),这才是真正意义上的抗体人源化。但起脚手架作用的FR不仅提供了CDR的空间构象环境,有时还参加抗体结合位点正确构象的形成,甚至参加与抗原的结合[3]。因此，简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体的亲和力。如何在FR中、FR和CDR之间进行操作,目前有几种策略[4]。

2.1 模板替换使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR[5]。

在选择人FR时一般有两条途径[6]。最初人们采用的一条途径是，对需要进行人源化的鼠McAb采用同一个(或少数几个)人源FR进行替换。已有晶体结构数据的

人源抗体的可变区框架(V

H 如NEW,KOL;V

L

如REI等)用作替换的基本模板,借助序

列比较与分子模建确定在人、鼠间有种源差异,尤其是鼠FR中与CDR有密切作用的氨基酸残基,保留在替换的人源FR中。为了保持CDR的空间构象,要特别注意原来抗体的CDR下面的堆积残基，以及CDR周围的残基。该途径的优点在于，确切的人源FR晶体结构为残基替换提供了较明确的信息,可排除很多盲目性;不足在于不易保持鼠CDR的天然构象,很可能降低或丧失抗体的亲和力。此外，要改变的氨基酸残基太多,降低了成功率。

第二条途径是，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠McAb FR有最大同源性的人源

FR用以替换。在选择同源的人FR时,先前的工作者[7]倡导将V

L 和V

H

作为一个整

体来考虑,寻找最高同源的人FR。其理由是同一个抗体的V

L 和V

H

在折叠上更能匹

配。以后的工作者则认为[8],将V

L 和V

H

分开考虑,分别寻找最高同源的对应序列,

更好地保持FR原来的框架,在整体上给鼠CDR提供最类似的环境。两种方法均有成功的实验报道。总之，同源替换主要考虑的是，鼠CDR在此背景下有类似的折叠环境,从而可保持原来的构象。同样需要分子模建来提供CDR移植后可能或缺的FR关键残基的信息。同源替换的优点是，能减少需要更改的氨基酸数目,更好地保持CDR需要的空间环境;不足的是选择的人源FR可能并无结构数据,不能提供有效的关键残基信息。

2.2 表面重塑对鼠CDR及FR表面残基进行镶饰(veneering)或重塑(resurfacing),以使之类似于人抗体CDR的轮廓(profile)或人FR的型式(pattern)[9]。

表面重塑途径的一个前提是，鼠McAb可变区的免疫原性起源于它的表面残基。因为现在普遍认为，残基的运动性和溶剂的可及性是其成为抗原决定簇的基本条件,因此表面残基理应携带绝大部分(如果不是全部)的抗原表位。溶液可及性表面残基的划分标准是，构成该残基的全部原子的30%以上是溶剂可及的。尽管人、鼠间抗体可变区表面暴露残基的精确型式有差别,但大多数的表面位置的残基类别有强烈的倾向性,仅仅考虑这种表面型式就可分出抗体可变区的组别。这说明抗体可变区表面至少也和框架区核心一样保守,表面型式的差别是人鼠间抗体的主要差别[10]。根据对现有的抗体晶体结构数据的分析结果统计,在序列配对位置上,人、鼠间抗体可变区残基的相对溶剂可及性分布的保真度达98%。这说明在异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶液可及表面残基引起的。将鼠特异性表面残基换成人源性的,就可模拟人源抗体的表面轮廓,逃避人体免疫系统的识别,达到人源化的目的。该策略可以不进行同源模建,在序列同源分析的基础上,选择与鼠表面残基暴露类型最相匹配的人源型式进行,但不够准确。另外,如果要改变的残基在侧链大小、电荷、疏水性,或有可能形成氢键从而影响到CDR 的构象,则不予改变。因为要改变的残基较少,能减少CDR-FR之间的不相容性。

该策略作为较新的一种人源化途径,还在逐步成熟阶段。鼠源McAb在人体引起的HAMA反应,究竟是完全由其表面的暴露残基引起，还是由表面残基与内部残基的共同贡献,涉及到抗体产生最基本的免疫学机制,而这种机制仍是目前探讨的热点。尽管有人认为［11］,即使在MHC背景下鼠源McAb被加工和提呈后包埋残基暴露出抗原性,但诱生的抗抗体也只能和降解的或解折叠的原抗体起反应,不会干扰原抗体的治疗效应。