双光子荧光探针研究及其应用_黄池宝
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摘 要 双光子荧光显微成像由于兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、 高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子 荧光显微成像, 为生命科学研究提供了更为锐利的工具。用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与 的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针, 是实现成像 的关键。双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展, 促进生命科学、医学科学的快速发 展, 同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。因此对双光子荧光探针的研究具有重要的 理论和实践意义。本文综述了双光子荧光显微成像的优点、双光子荧光探针设计的原理及双光子荧光探针 在离子分析方面的应用, 并展望了这类荧光探针的发展趋势与应用前景。
合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子
能大大促进双光子荧光显微成像在生物系统中的应 用, 包括单分子检测[ 10] 、免疫测定[ 11] 、DNA 片断测 定[ 12] 、化学和生物 传感器[13] 、生 物微芯片[14] 、毛 细 管分离检测等[15] 。在大量的实 验和理论研究 基础 上, 人们总结出有机双光子吸收材料的一些结构- 性 能关系, 提出了许 多行之有效的设 计及合成策略, 大大推动了双光子吸收应用的发展[ 4, 6, 16 ) 20] 。
关键词 双光子荧光成像 双光子荧光探针 荧光 探针 化学传感器 中图分类号: O65713 文献标识码: A 文章编号: 1005- 281X( 2007) 11- 1806- 07
Progress and Application of Two-Photon Fluorescent Probes
Huang Chibao1, 2 Fan Jiangli 1 Peng Xiaojun1* * Sun Shiguo1 ( 1. State Key Laboratory of Fine Chemicals, The School of Chemical Engineering, Dalian University of Technology,
基于上述优点, 加之使用较长波长的光来激发 样品, 可以避免紫外光对样品的伤害和使用复杂的 紫外光学元件的许多限制, 同时可以延长对活体生 物样品的观察时间, 双光子共焦激光扫描显微镜为 研究氨基酸、蛋白质和神经递体( neuro transmitter) 等 提供了独特而重要的方法。例如, Denk 等[ 3] 用波长 为 630 nm 的激光进行双光子激发, 获得了分辨率达 200 nm 的猪肾细胞分裂期染色体的荧光像, 因此, 双光子荧光显微成像术成为生物分子检测[21, 22] 、活 性细 胞的 超 分 辨 率 层析 成 像[ 23, 24] 等 研 究 的重 要
Key words two- photon fluorescence imaging; two- photon fluorescent probes; fluorescence; probes ( sensors) ; chemosensors
收稿: 2006 年 11 月, 收修改稿: 2007 年 1 月 * 国家自然科学基金重点项目( No. 20472012、20376010) 资助 * * 通讯联系人 e-mail: pengxj@ dlut. edu. cn
双光子荧光探针的研究是近几年才兴起的一个 崭新领域, 亟待更多的新研究成果问世, 以填补这一 领域的空白。目前已有的研究从识别客体来说仅局
限于离子探针与 pH 探针, 还没有以分子为 识别对 象的探针问世; 而从探针识别的机理来说仍囿于分 子内电荷迁移( ICT) 和共振能量迁移 ( RET ) 这两种 作用机制, 尚无光诱导电子迁移( PET ) 探针的报道; 从识别离子种类来看, 仅有铅离子、钙离子、镁离子 及氟离子这 4 种离子探针。本文主要就双光子荧光 成像的优点、双光子荧光探针的设计原理、近年来双
光子荧光探针在结构特性和与客体的作用方式及其 在离子分析方面的应用进展作简要综述, 并展望了 此类探针的发展趋势和应用前景。
双光子共焦显微镜与单光子共焦显微镜相比具 有许多突出的优点: ( 1) 双光子共焦显微镜可以采用 波长比较长的、在生物组织中穿透能力比较强的红
外激光作为激发光源, 因此可以解决生物组织中深 层物质的层析成像问题; ( 2) 由于双光子荧光波长远 离激发光波长, 因此双光子共焦显微镜可以实现暗 场成像; ( 3) 双光子荧光可以避免普通荧光成像中的 荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题; ( 4) 双光 子跃迁具有很强的选择激发性, 有利于对生物组织 中一些特殊物质进行成像研究; ( 5) 双光子共焦显微 镜具有更高的横向分辨率和纵向分辨率, 由于材料 的双光子吸收强度强烈地与激发光强的平方相关, 因而在紧聚焦的条件下, 双光子吸收仅局限于物镜 焦点处的空间体积约 K3 的小范围内, 甚至不使用共 焦小孔就能得到高清晰的三维图像, 使共焦显微镜 的设计大为简化, 易于操作; ( 6) 双光子共焦显微镜 使用红外激光作为激发光源, 能大大地降低生物组 织对激发光的吸收, 可获得较强的样品荧光; ( 7) 由 于组织中自发荧光物质的激发波长一般都在 350 ) 560 nm 的范围内, 因此使用红外激光作激发光源的 双光子荧光显微镜能避免组织自发荧光的干扰。
# 1808 #
化学进展
第 19 卷
微和成像技术的发展产生极大的促进作用。
3 双光子荧光探针设计的一般原理
3. 1 双光子荧光探针发生作用的机理 双光子荧光探针与单光子荧光探针的设计原理
基本是一致的, 作为一 个探针分子, 它由两部 分组 成: 一是荧光团( fluorophore) ; 二是离子团( ionophore) 或称作受体( receptor) , 不一定局限于离子, 从广义上 讲, 发生作用的对象除了离子外还有分子甚至大分 子, 因此最好称作受体。从作用机制来讲有如下几 种: 一是分子 内电荷迁 移机理 ( intramolecular charge transfer, ICT) , 受体与客体作用后削弱了受体的供电 能力, 导致荧光团上的电子云密度降低。如果受体 结合客体前对荧光团表现为供电基, 则体系的荧光 减弱; 反之, 则荧光增强。在 ICT 过程中常伴有吸收 波长与发射波长的红移或蓝移( 图 1) 。二是光诱导 电子 迁移过 程( photoinduced electron transfer, PET ) ,
工具。
常规的双光子共焦显微和成像, 通常采用传统 的荧光物如荧光素等作为双光子荧光发射体。这些
荧光物的双光子吸收截面较小, 在实验中必须采用 高强度激光激发高浓度荧光物的措施来获得足够强
的上转换荧光, 这样加大了活体生物样品的观测难 度。因此, 寻求具有高荧光量子产率和大双光子吸 收截面的 材料是这个领域 的热点。例如, 2001 年, V entelon 等[6] 在二氢菲衍生物中获得了荧光量子产 率高达 86% 和双光子吸收截面是荧光素分子1 000 多倍的结果。这些研究的深入将会对双光子共焦显
Dalian 116012, China; 2. Department of Agricultural Engineering, Yingdong Bioengineering College, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)
Abstract Two- photon fluorescence imaging with such properties as NIR( near infrared ) photons as excitation source, imaging in the black background, avoidance of photodamage and photobleaching, fixed target excitation, high transverse and longitudinal resolutions, small absorpt ion coefficient of light in tissue, lower tissue auto-f luorescence, etc. is superior to one- photon fluorescence imaging, and is a powerful tool for life science studies. Two- photon fluorescence probes applied to studies on the contents of ions and the effects of their contents upon physiology, physiological action mechanisms of ions, interplays between ions and molecules, distributions of specific molecules and their interact ions, and so on, play an important role in imaging. The aim of the studies on two- photon fluorescence probes is to promote the developments of the applications for two- photon fluorescence microscopies, life science and medicine, and chemistry to which two- photon fluorescence probes are subject. Undoubtedly, the developments and applications of two-photon fluorescence probes are significantly meaningful in theory and pract ice. The advantages of two- photon fluorescence imaging, the principles of design for two- photon fluorescent probes and their applications in ions analyses are reviewed. In part icular, the prospects in the future are also discussed.
相互作用等, 这对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药 物筛选等领域的发展具有重要的意义。
双光子吸收是指在强光激发下, 介质分子同时 吸收两个光子, 从基态跃迁到两倍光子能量的激发 态的过程。早在 1931 年, GÊpper-t Mayer[ 1] 就在 理论 上预言了双光子吸收的存在。但是, 直到上世纪 60 年代初激光器出现后, 才由 Kaiser 等[ 2] 首先 从实验 上证实了双光子吸收过程。然而, 由于一般材料的 双光子吸收截面很小, 双光子吸收的实际应用受到 限制, 使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。 1990 年, 美国康奈尔大学 Denk 等[ 3] 提出将双光子激 发现象应用到共焦激光扫描显微镜中, 开辟了双光 子荧光显微和成像这个崭新的领域。近年来, 有机 双光子吸收材料在诸多领域, 尤其是双光子荧光显 微和成像中的应用得到了广泛的关注[ 4 ) 9] 。设计和
第 19 卷 第பைடு நூலகம்11 期 2007 年 11 月
化 学 进展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol. 19 No. 11 Nov. , 2007
双光子荧光探针研究及其应用*
黄池宝1, 2 樊江莉1 彭孝军1* * 孙世国1
( 1. 大连理工大学化工学院 精细化工国家重点实验室 大连 116012; 2. 韶关大学英东生物工程学院 农业工程系 韶关 512005)
第 11 期
黄池宝等 双光子荧光探针研究及其应用
# 1807 #
1 引言
2 双光子荧光显微成像的优点
双光子荧光显微镜是生物活体组织成像的一个 重要工具, 愈来愈受到人们的重视。为了使双光子 荧光显微镜获得最大范围的应用, 开发有效的双光 子荧光探针十分必要。利用双光子荧光探针, 可研 究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理 活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其
合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子
能大大促进双光子荧光显微成像在生物系统中的应 用, 包括单分子检测[ 10] 、免疫测定[ 11] 、DNA 片断测 定[ 12] 、化学和生物 传感器[13] 、生 物微芯片[14] 、毛 细 管分离检测等[15] 。在大量的实 验和理论研究 基础 上, 人们总结出有机双光子吸收材料的一些结构- 性 能关系, 提出了许 多行之有效的设 计及合成策略, 大大推动了双光子吸收应用的发展[ 4, 6, 16 ) 20] 。
关键词 双光子荧光成像 双光子荧光探针 荧光 探针 化学传感器 中图分类号: O65713 文献标识码: A 文章编号: 1005- 281X( 2007) 11- 1806- 07
Progress and Application of Two-Photon Fluorescent Probes
Huang Chibao1, 2 Fan Jiangli 1 Peng Xiaojun1* * Sun Shiguo1 ( 1. State Key Laboratory of Fine Chemicals, The School of Chemical Engineering, Dalian University of Technology,
基于上述优点, 加之使用较长波长的光来激发 样品, 可以避免紫外光对样品的伤害和使用复杂的 紫外光学元件的许多限制, 同时可以延长对活体生 物样品的观察时间, 双光子共焦激光扫描显微镜为 研究氨基酸、蛋白质和神经递体( neuro transmitter) 等 提供了独特而重要的方法。例如, Denk 等[ 3] 用波长 为 630 nm 的激光进行双光子激发, 获得了分辨率达 200 nm 的猪肾细胞分裂期染色体的荧光像, 因此, 双光子荧光显微成像术成为生物分子检测[21, 22] 、活 性细 胞的 超 分 辨 率 层析 成 像[ 23, 24] 等 研 究 的重 要
Key words two- photon fluorescence imaging; two- photon fluorescent probes; fluorescence; probes ( sensors) ; chemosensors
收稿: 2006 年 11 月, 收修改稿: 2007 年 1 月 * 国家自然科学基金重点项目( No. 20472012、20376010) 资助 * * 通讯联系人 e-mail: pengxj@ dlut. edu. cn
双光子荧光探针的研究是近几年才兴起的一个 崭新领域, 亟待更多的新研究成果问世, 以填补这一 领域的空白。目前已有的研究从识别客体来说仅局
限于离子探针与 pH 探针, 还没有以分子为 识别对 象的探针问世; 而从探针识别的机理来说仍囿于分 子内电荷迁移( ICT) 和共振能量迁移 ( RET ) 这两种 作用机制, 尚无光诱导电子迁移( PET ) 探针的报道; 从识别离子种类来看, 仅有铅离子、钙离子、镁离子 及氟离子这 4 种离子探针。本文主要就双光子荧光 成像的优点、双光子荧光探针的设计原理、近年来双
光子荧光探针在结构特性和与客体的作用方式及其 在离子分析方面的应用进展作简要综述, 并展望了 此类探针的发展趋势和应用前景。
双光子共焦显微镜与单光子共焦显微镜相比具 有许多突出的优点: ( 1) 双光子共焦显微镜可以采用 波长比较长的、在生物组织中穿透能力比较强的红
外激光作为激发光源, 因此可以解决生物组织中深 层物质的层析成像问题; ( 2) 由于双光子荧光波长远 离激发光波长, 因此双光子共焦显微镜可以实现暗 场成像; ( 3) 双光子荧光可以避免普通荧光成像中的 荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题; ( 4) 双光 子跃迁具有很强的选择激发性, 有利于对生物组织 中一些特殊物质进行成像研究; ( 5) 双光子共焦显微 镜具有更高的横向分辨率和纵向分辨率, 由于材料 的双光子吸收强度强烈地与激发光强的平方相关, 因而在紧聚焦的条件下, 双光子吸收仅局限于物镜 焦点处的空间体积约 K3 的小范围内, 甚至不使用共 焦小孔就能得到高清晰的三维图像, 使共焦显微镜 的设计大为简化, 易于操作; ( 6) 双光子共焦显微镜 使用红外激光作为激发光源, 能大大地降低生物组 织对激发光的吸收, 可获得较强的样品荧光; ( 7) 由 于组织中自发荧光物质的激发波长一般都在 350 ) 560 nm 的范围内, 因此使用红外激光作激发光源的 双光子荧光显微镜能避免组织自发荧光的干扰。
# 1808 #
化学进展
第 19 卷
微和成像技术的发展产生极大的促进作用。
3 双光子荧光探针设计的一般原理
3. 1 双光子荧光探针发生作用的机理 双光子荧光探针与单光子荧光探针的设计原理
基本是一致的, 作为一 个探针分子, 它由两部 分组 成: 一是荧光团( fluorophore) ; 二是离子团( ionophore) 或称作受体( receptor) , 不一定局限于离子, 从广义上 讲, 发生作用的对象除了离子外还有分子甚至大分 子, 因此最好称作受体。从作用机制来讲有如下几 种: 一是分子 内电荷迁 移机理 ( intramolecular charge transfer, ICT) , 受体与客体作用后削弱了受体的供电 能力, 导致荧光团上的电子云密度降低。如果受体 结合客体前对荧光团表现为供电基, 则体系的荧光 减弱; 反之, 则荧光增强。在 ICT 过程中常伴有吸收 波长与发射波长的红移或蓝移( 图 1) 。二是光诱导 电子 迁移过 程( photoinduced electron transfer, PET ) ,
工具。
常规的双光子共焦显微和成像, 通常采用传统 的荧光物如荧光素等作为双光子荧光发射体。这些
荧光物的双光子吸收截面较小, 在实验中必须采用 高强度激光激发高浓度荧光物的措施来获得足够强
的上转换荧光, 这样加大了活体生物样品的观测难 度。因此, 寻求具有高荧光量子产率和大双光子吸 收截面的 材料是这个领域 的热点。例如, 2001 年, V entelon 等[6] 在二氢菲衍生物中获得了荧光量子产 率高达 86% 和双光子吸收截面是荧光素分子1 000 多倍的结果。这些研究的深入将会对双光子共焦显
Dalian 116012, China; 2. Department of Agricultural Engineering, Yingdong Bioengineering College, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)
Abstract Two- photon fluorescence imaging with such properties as NIR( near infrared ) photons as excitation source, imaging in the black background, avoidance of photodamage and photobleaching, fixed target excitation, high transverse and longitudinal resolutions, small absorpt ion coefficient of light in tissue, lower tissue auto-f luorescence, etc. is superior to one- photon fluorescence imaging, and is a powerful tool for life science studies. Two- photon fluorescence probes applied to studies on the contents of ions and the effects of their contents upon physiology, physiological action mechanisms of ions, interplays between ions and molecules, distributions of specific molecules and their interact ions, and so on, play an important role in imaging. The aim of the studies on two- photon fluorescence probes is to promote the developments of the applications for two- photon fluorescence microscopies, life science and medicine, and chemistry to which two- photon fluorescence probes are subject. Undoubtedly, the developments and applications of two-photon fluorescence probes are significantly meaningful in theory and pract ice. The advantages of two- photon fluorescence imaging, the principles of design for two- photon fluorescent probes and their applications in ions analyses are reviewed. In part icular, the prospects in the future are also discussed.
相互作用等, 这对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药 物筛选等领域的发展具有重要的意义。
双光子吸收是指在强光激发下, 介质分子同时 吸收两个光子, 从基态跃迁到两倍光子能量的激发 态的过程。早在 1931 年, GÊpper-t Mayer[ 1] 就在 理论 上预言了双光子吸收的存在。但是, 直到上世纪 60 年代初激光器出现后, 才由 Kaiser 等[ 2] 首先 从实验 上证实了双光子吸收过程。然而, 由于一般材料的 双光子吸收截面很小, 双光子吸收的实际应用受到 限制, 使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。 1990 年, 美国康奈尔大学 Denk 等[ 3] 提出将双光子激 发现象应用到共焦激光扫描显微镜中, 开辟了双光 子荧光显微和成像这个崭新的领域。近年来, 有机 双光子吸收材料在诸多领域, 尤其是双光子荧光显 微和成像中的应用得到了广泛的关注[ 4 ) 9] 。设计和
第 19 卷 第பைடு நூலகம்11 期 2007 年 11 月
化 学 进展
PROGRESS IN CHEMISTRY
Vol. 19 No. 11 Nov. , 2007
双光子荧光探针研究及其应用*
黄池宝1, 2 樊江莉1 彭孝军1* * 孙世国1
( 1. 大连理工大学化工学院 精细化工国家重点实验室 大连 116012; 2. 韶关大学英东生物工程学院 农业工程系 韶关 512005)
第 11 期
黄池宝等 双光子荧光探针研究及其应用
# 1807 #
1 引言
2 双光子荧光显微成像的优点
双光子荧光显微镜是生物活体组织成像的一个 重要工具, 愈来愈受到人们的重视。为了使双光子 荧光显微镜获得最大范围的应用, 开发有效的双光 子荧光探针十分必要。利用双光子荧光探针, 可研 究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理 活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其