蛋白质定位方法

gfp
蛋白质研究
将GFP作为荧光探针，与要研究的蛋白质融合在一起， 进行活细胞内蛋白质的分布与变化研究。此方法在过去几 年中对细胞生物学的观察有着显著影响。 水稻的CaM类蛋白OsCaM61，含有N一端CaM区域，C端 有异戊二烯化位点。将OsCaM61与GFP融合起来，研究其亚 细胞定位，发现GFP- OsCaM61融合蛋白是膜结合的，而 OsCaM61-GFP却主要在核质。用mevinolin处理细胞，阻止 类异戊二烯合成，引起GFP- OsCaM61运输到核质。前者C 端的异戊二烯化位点是活跃的而后者的位点被掩盖。此蛋 白的异戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。亚细胞 定位依赖于蛋白的异戊二烯化状态，表明在不同的生理条 件下，这种类CaM可能通过结合到定位于不同细胞成分的 靶子上，起到不同的功能作用(Aiwa Dong et a1.,2002)
蛋白质定位方法之与gfp构建融合基 因，用荧光显微镜观察
姓名：刘怀禹 学号：2013211016
导言
真核细胞具有复杂的亚细胞结构， 已发现数十种细胞器，每种细胞器都 有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿 体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成， 最终运送到不同地点，形成成熟蛋白 并行使功能。转译产物中很大一部分 是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白 分子定位信号，可引导蛋白在胞内定 位。蛋白质在细胞内的定位问题，是 细胞生物学研究的中心问题，也是分 子生物学研究的热门话题。目前，这 方面的工作己取得很人进展。细胞器 不同，相应的靶向蛋白的定位过程也 不同。
GFP及其在生命科学研究中的应用
简介GFP 海洋生物发光是个非常普遍的现 象。从原生生物到脊椎动物均有生物发 光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不 同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性 质不尽相同，不同动物荧光发生机制有 很大差别。多管水母体内存在两种发光 蛋白绿色荧光蛋白:GFP和aequorin。当 aequorin与3个Ca2+结合后，即发生氧化 反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。 GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光 (Morise, H.，Shimomura,1974)。
GFP在水母体内的发光机制如下：
GFP荧光的产生主要归功于分子内 第65, 66, 67位丝氨酸、酪氨酸、甘 氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋 白折叠环化后，在O2存在下分子内第 67位甘氨酸的酰基对第65位丝氨酸的 羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑 基，第66位酪氨酸的a-β 键脱氢反应 之后，导致芳香团与咪唑基结合。这 样GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环 酮生色团，该过程可自动催化合成 (Heim R,Douglas CP.,1994)
原理
应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因 构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、 显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利 用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信 号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察 系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态。
目的基因
融合基因

转化
表达
荧光显微观察
GFP晶体结构(如图)显示：
蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm, 宽240nm，由11个围绕中心a螺旋的反平行β 折叠组 成，荧光基团的形成是从这个螺旋开始，桶的顶部 由3个短的垂直片段覆盖，底部由1个短的垂直片段 覆盖，生色团位于大空腔内(CubittAB, 1999)。
GFP在生命科学研究中的应用
GFP虽能自发荧光，但野生型GFP荧光较弱。为了改善GFP荧光特性， 对GFP进行了突变和重组实验。Pang等获得的GFP突变型比野生型亮度 增强20倍;Tian等发现野生型GFP是低水平表达，而改良后的GFP表达 量增加100倍。Cormack等获得的三位点替代突变体的荧光强度比野生 型高100倍，而且在自然光下就能观察到绿色荧光，使得gfp作为报告 基因更为灵敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非检测点的 杂散荧光和非焦平面荧光的干扰，使分辨率提高，获得清晰图象，而 且它具有逐层扫描功能，可对组织细胞进行无损伤的系列光学切片。 Confocal的应用更有利于GFP在生物学研究中的应用。
A、B:仅转入GFP
C、D:转入PF40-GFP融合蛋白
用GFP还可以用于基因沉默、启动子活性、细胞信号转 导和细胞局部区域的pH、内生菌和植物相互作用研究等。 GFP在动物学研究方面的应用也非常广泛(比如用于研究肿瘤 发生机制、转移机制、基因治疗等)。 gfp用作报告基因有众多优点：1灵敏度高，易检测并且 是活体检测，对细胞组织不具破坏性。而当选用gus作报告 基因时，在组织学检测时，一定程度上具有破坏性。因为要 对材料进行固定，保温和脱色，并且植物中存在GUS本底， 影响检测的准确性；2在活体内表达不受生物类型、基因型、 细胞和组织类型的限制；3不需任何底物和外源辅因子参与； 4便于早期筛选转基因材料。 GFP在生物学研究中应用广泛，有很大优越性，但也存 在一定的问题。GFP的检测受背景荧光和光漂白现象的限制， 它的过量表达对细胞是有毒的，转化细胞再生能力下降。实 验中很难建成GFP稳定细胞株，可能与GFP参与细胞凋亡有关。