第二十四章反义药物

天然反义寡核苷酸的作用弱而短暂，如何进行结构上的化学
修饰使其透膜性增强、防止被酶水解、提高其抑制效应
具有重要意义，目前已找到一些有效的修饰方法，如硫
代、甲基化等。
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反义核酸技术的历史
既然存在反义核酸，核酸指导编码合成的蛋白质是否也存在 反义呢？
这当然是一种科学的假设，研究业已证实不仅存在反义蛋白 质，而且它与反义核酸一起在世界上已形成一门独特的 新技术----反义技术（antisense technology）。
当前反义药物治疗肺癌大规模临床试验失败。
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反义核酸技术的应用
在生命科学基础研究领域中的应用
在医学方面的应用
目前唯一被美国食品与药品管理局(FDA)批 准上市的反义ODN药物是Isis制药公司生产的福 米韦生（ISIS2922），此药由21个硫代磷酸酯寡 聚脱氧核苷酸组成，核苷酸序列为5’GCGTTTGCTCTTCTTCTTGC-3’，主要用于治 疗艾滋病患者并发的巨细胞病毒（CMV）性视网 膜炎。
c：与目标序列结合； d ： RNase H 酶 裂 解 目 标
mRNA
蛋白质
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反义核酸技术的历史
时间/年 事件
人或机构
1953 首次提出“反义”定义
Watson
1957 三螺旋核酸概念的提出
Davies
1969 第一代反义核酸药物（福米韦生，Fomivirsen）诞 Isis制药公司
生
1978 首次应用合成的寡核苷酸成功的抑制基因的表达 Zamenick和Stephenson
1980 ColE1 DNA复制研究中发现反义调节机制
Itoh和Tomizawa
1981 第二代反义核酸药物
Hybridon公司
1984 首次提出反义核酸可用于下调原核生物与真核生 Coleman等
物基因的表达
1987 首次报道反义链下调一种细菌基因的表达
Rothstein
1988 首次报道反义基因下调一种植物基因的表达
副作用
反义药物的主要副作用根据毒发原因可分为两类：一类是以药效学为基础的毒性，是 其反义作用过强或与非靶基因产生反义作用而导致的毒性；另一类毒性是寡核苷 酸与其它分子（如蛋白质）非特异性相互作用的结果，主要有补体激活、免疫刺 激、凝血时间长、肝肾毒性、致死性的血液动力学改变等。为克服这些缺陷，常 对药物分子进行修饰（如封闭硫代磷酸链中的多阴离子），采用局部给药方式， 或选择合适而专一的作用靶点，以提高药物治疗的选择性。
性，增加对核酸酶的抗性。
溶解性
由于ASON带负电荷且有较强的亲水性，因此不易与带同
样电荷的靶细胞接触，更不易透过由磷酯质双分子层构
成的细胞膜进入细胞内。
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化学修饰
碱基修饰
在胞嘧啶的5号位点进行甲基化是最常用的碱基修饰手 法
骨架修饰
核苷酸通过磷酸二酯键连接成核酸或ASODN，磷酸二 酯键是受核酸酶作用（水解）的敏感位点，在体内生 理条件下半衰期仅数分钟。
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反义技术的定义
反义技术（antisense technology）就是采 用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基 因的技术 。
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反义核酸作用机理
反义寡脱氧核苷 酸
mRNA 翻译
DNA转蛋白录质
前体-mRNA
mRNA 翻译
抑制mRNA翻译： a：RNA与核糖体作用的空 间位阻；
b：阻碍mRNA从核内到细 胞质的通道；
长期毒性
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反义核酸类药物必须符合的条件
选择性
一般而言，只要人工设计合成12个碱基以上基因序列的 反义DNA或反义RNA（即反义寡脱氧核苷酸或反义寡核 苷酸），就足以使此反义核酸与靶mRNA形成结合作用， 且这种结合调节是非常特异性的。
稳定性
人们需对反义核酸的结构进行化学修饰以提高其稳定
在农业中的应用
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反义核酸类药物的特点
反义核酸药物的优点 反义药物的体内稳定性和副作用 反义核酸类药物必须符合的条件
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反义核酸药物的优点
高度特异性
原则上，反义技术可以针对任何已知序列的基因设计药物 来特异地抑制其表达。
高效
最优化药物设计
安全低毒
反义寡核苷酸尚未发现显著毒性，尽管它在生物体内的存 留时间有长有短，但最终都将被降解清除，这避免了如转 基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。
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反义核酸技术的历史
Itoh和Tomizawa（1980）在研究ColE1的实验中， 最先发现自然界存在“天然”反义RNA。
上述发现不仅从一个角度证实了“天然”的DNA双螺旋结构
模型中反义链在转录过程中的指导作用，而且它就像掀
去一层又一层薄薄的面纱，展示给人们一个朦胧神奇、
奥妙无穷的新的研究领域，从而曾强了人们深入研究反
义基因、反义寡核苷酸的信心。此后，寡核苷酸合成技
术的发展、DNA合成仪的出现，如此种种新技术的推波
助澜使反义领域里的研究硕果累累，树立起了一个个里
程碑。
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反义核酸技术
反义RNA
根据其作来自百度文库机制可将其分为3类
①反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和（或） 部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合 形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ降解；
低mRNA的稳定性。反义作用也可以通过不同的机制共同起作用。
另外，骨架的修饰也会影响寡核苷酸激活RNase H的能力，如甲基磷
酸酯化合物不能激活RNase H，硫代磷酸化合物（PS-ODN）却是
RNase H很好的底物。
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反义核酸类药物的通用生产方法与 技术
反义核酸药物的设计 反义核酸药物的生产方法
醇含量及主动脉表面积病变百分率显著降低，
有效抑制主动脉粥样硬化和发展。
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在神经系统疾病方面
有文献报道反义ODN在治疗阿尔茨 海默病和脑获得性免疫缺陷综合症 的效果。
随着神经细胞和器官培养技术的进 展，反义ODN在脑研究和神经性疾 病治疗方面也将取得广泛的应用。
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反义核酸类药物的作用机理
反义核酸的作用靶点 反义核酸的作用机制
②反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起 mRNA的象变化，抑制降解；
③反义RNA直接抑制靶mRNA的转录。
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反义核酸技术
反义DNA
反义DNA是指一段能与特定的DNA或RNA以碱基互 补配对的方式结合，并阻止其转录和翻译的短核酸片 段，主要指反义寡核苷酸，因具重要应用价值而备受 重视。
占位激活的降解
降解机制是指通过激活RNase来降解靶mRNA，如激活RNase H，也可
激活其它RNase如RNaseⅢ、RNase L、RNase P等。另一方面可利 用RNA分子调节自身代谢的能力来影响其稳定性，如阻止mRNA 的5’加帽、3’polyA加尾，结合在mRNA5’和3’非翻译区来降
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反义核酸的作用靶点
反义核酸通过Watson-Crick碱基配对或通过与基因上特定序列形成
三股螺旋来下调某一特定基因的表达，已确定反义核酸可在mRNA的
转录、剪接、加工、转运、翻译及降解等各个环节起作用。
DNA复制水平
DNA复制时需要一段适当的RNA引物，而反义核酸可以和引物互补结合， 使引物不能以适当的构象结合到DNA模板上，从而使复制受到抑制。
列形成双链，阻碍mRNA前体的加帽、拼接、加poly A尾及向胞质
的转运。
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反义核酸的作用靶点
抑制转录后mRNA的剪接和成熟
如5’端加帽、3’端加尾（poly A）和pre-RNA的剪接等。
阻止 mRNA由细胞核向细胞质运输
寡核苷酸可进入细胞核，在核内与靶mRNA或pre-mRNA结合， 阻止它们由细胞核向细胞质的运输。
转录水平
三链寡核苷酸（triplex-forming oligonucletide，TFO）可与基因DNA双螺旋 的调控区特异结合形成DNA三螺旋结构，抑制基因的转录。
反义DNA可与基因组DNA结合
反义核酸与靶mRNA形成的DNA-RNA复合物
反义核酸的另一作用方式是与靶基因转录的mRNA前体的特殊序
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反义核酸技术的历史
反义寡核苷酸与靶序列结合是其发挥效应的第一步，研究两 者结合的理论机制包括亲和性、特异性、核酸选择性及 核酸空间结构等问题。
反义核酸（寡核苷酸）抑制基因表达的机理是关键性理论问 题，人们也已提出种种理论模型（学说）：占位抑制、 转录抑制、拼接抑制、翻译抑制、占位失衡及空间结构 学说、5’端加帽阻抑、3’多腺嘌呤核苷酸化抑制、RNA 酶H激活等。
经济方便
• 反义药物的合成是相对容易的
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反义药物的体内稳定性和副作用
根据现有的临床结果，无论是从疗效、短期毒性、药代动力学，还是从应用 的广泛性来看，反义药物都有望成为常规药物。
稳定性
反义药物在细胞内常常被内源性核酸酶降解，其稳定性一直是反义基因治疗的瓶颈之 一。
一种新近发展起来的技术是选择功能强大的启动子构建真核表达载体，在细胞内源源 不断地转录产生反义片段，不失为反义给药的一种新途径。
翻译水平
反义核酸一方面可以通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应，阻
止核糖体与mRNA结合或核糖体在mRNA上的移动（翻译捕
获）；另一方面在与mRNA结合后可激活内源性RNase或核酶，
降解mRNA。
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反义核酸的作用靶点
占位介导的机制
传统的受体-拮抗剂理论是指通过阻止受体的天然激动剂的结合来改变 其生物学活性。
Van der Krol
1988 一段27bp的三链结构寡核苷酸序列特异性抑制c- Cooey
myc的转录
1990 1997
首次报道正义基因下调植物基因的表达 反义P120抑制MIA Pa Ca-2细胞
Napoli和Van der Krol返 回
Freeman
反义核酸技术的历史
1978年已第一次成功地应用合成的寡核苷酸来 调节基因的表达。随着反义技术的发展和成熟， 其已被逐渐应用于治疗各种疾病的研究。第 一个反义寡核苷酸药物福米韦新已经在美国 和欧洲获准上市，该药物主要用于治疗一些 艾滋病患者的巨细胞病毒性视网膜炎，这些患 者往往对其它治疗方案不能耐受，或是有禁忌 症或普通药物没有明显效果等。
可将此骨架换成聚酰胺(nylon)、吗啡啉(mophilin)、碳胺 酯(carbamate)或肽骨架(peptide)，它们不仅非常稳定， 而且也有相当的抗病毒活性。
研究得最多的化学修饰即是磷原子，如硫代、甲基化、
胺化和酯化等。α-构型修饰
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反义核酸类药物的功用
在癌症治疗方面 在抗病毒方面 在心血管疾病方面 在神经系统疾病方面
第二十四章 反义药物
反义药物
1. 反义技术简介 2. 反义核酸类药物的特点 3. 反义核酸类药物的功用 4. 反义核酸类药物的作用机理 5. 反义核酸类药物的通用生产
方法与技术 6. 典型反义核酸类药物生产技
术及工艺 7. 反义类药物的发展前景与展
望
结束
反义技术简介
定义 反义核酸技术的机理 历史 反义核酸技术
核酶转录单位 反义核酸药物的给药途径
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反义核酸药物的设计
靶位点的选择 非Watson-Crick碱基对的应用 核酶转录单位 反义核酸药物的给药途径
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反义核酸技术
核酶（ribozyme）是具有酶活性的RNA，主要参加
RNA的加工与成熟。
天然核酶可分为四类：
①异体催化剪切型，如RNase P；
②自主催化剪切型，如植物类病毒，拟病毒和卫 星RNA；
③第一组内含子自我剪接型；如四膜虫大核26S rRNA；
④第二组内含子剪接型。
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在心血管疾病方面
1988年，Sugano M研究了以去唾液酸糖蛋白 （A-SOR）载体分子偶合的反义ODN与胆固 醇喂养的兔子动脉粥样硬化间的关系。
结果表明，注射反义ODN与对照组和正义
ODN(Sense ODN)相比较，不仅胆甾型酯转
移蛋白（CETP）mRNA减少和低密度脂蛋白
（LDL）受体mRNA增加，而且主动脉胆固
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在癌症治疗方面
对反义药物特异性抑制癌基 因的表达，进而抑制肿瘤细 胞增殖的研究已取得成功， 已完成二期临床的PKC-α （蛋白激酶-C）反义化合物， 可使卵巢癌患者的盆腔肿块 消退，使结肠癌的癌胚抗原 （CEA）维持稳定。
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在抗病毒方面
Abdou等又验证了在人肠癌细胞 含肠冠状病毒基因间同感序列的峰形 蛋白mRNA起始编码区完全互补的18 聚反义ODN的抗病毒活性，磷酸二酯 ODN病毒抑制率为12%-34%，而经修 饰的硫代磷酸以p-环糊精衍生物为载 体的磷酸二酯ODN病毒抑制率为56%90%。