遗传实验——苯硫脲尝味的遗传学调查

苯硫脲尝味的遗传学调查学院：

年级：

专业：

学号：

姓名：

苯硫脲尝味的遗传学调查

摘要：苯硫脲(phenylthiocarbamide,PTC)是一种白色结晶状的化学物质,有苦味。人类对PTC 苦味的品尝能力受遗传(基因)的控制,区分为PTC 尝味者和味盲两群。通过测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。从而了解cleaved amplified polymorphic sequence技术的原理，学会用CAPS 技术检测单核苷酸多态性在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。最后计算群体中PTC 尝味的基因频率，判断群体是否达到Hardy-weiberg 平衡。

关键词：PTC；基因型；表现型

Abstract：PTC is a white crystalline substance, a bitter taste. Human PTC bitter tasting ability by genetic ( gene ) control, divided into PTC taster and taste blindness two group.Through the determination of the crowd PTC tasting gene phenotype and genotype, understanding Mendel heritable genotype with phenotype and corresponding relationship. In order to understand the cleaved amplified polymorphic sequence principles, to learn how to use CAPS technique for detection of single nucleotide polymorphism in the molecular level determination of PTC tasting genotype. The final calculation of group PTC taste of gene frequency, judging whether to group Hardy-weiberg balance.

通过这一综合性实验，提高同学们对遗传学的兴趣，对遗传学进行进一步探究，并且对伟大理论的亲自实践，以及各种基本实验技术的掌握。

正文：苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物，为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,000~1/50,000 PTC 浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲“尝味者（taster）”；只能尝出PTC 浓度大于1/24,000 溶液的味道（甚至对PTC 的结晶物也尝不出苦味）的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”。

PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7 号染色体上

（7q35-7q36）的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38 决定的，属于常染色体不完

全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1／750,000~ 1／6,000,000

的PTC 溶液的苦味，杂合子(Tt) 只能尝出1／480,000～l／380,000 的PTC 溶液的苦味。因此可以利用对PTC 的尝味能力测定家族中的基因传递和人群中的基因频率。

人类的PTC尝味基因Homo sapiens taste receptor, type 2, member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38 或T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：一处是145 位，味盲者为G145（编码丙氨酸ala）尝味者为C145，（编码脯氨酸pro）；第二处是785 位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸，尝味者为G886（编ala）；第三处在886 位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile）码缬氨酸val）。因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262，被称为A VI 等位基因，而尝味者的三处是pro49、ala262 和val262，被称为PA V 等位基因。

味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1 的识别位点（识别序列5’-GC↓NGC-3’），如果是尝味者，则其第785 位SNP 恰好形成了一个额外的Fnu4H1 识别位点（GCTGC）因此可以利用这个SNP 造成的限制性位点多态性，。设计引物扩增包含785 位SNP 位点的PTC 基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。

1 实验流程

1.1 实验前准备

Madam苏准备了不同浓度的PTC试液以及其他前期准备，我们在实验前查阅了大量的有关文献，并且向师兄师姐求教各种经验。

（1）（1 号液）称取PTC 结晶0.65 g，原液：加娃哈哈纯净水500 ml，在室温(20℃左右)下溶解l~2d（经常摇晃）（或60℃水浴中1 h 充分溶解），PTC 浓度约为1／750，过滤灭菌。

（2）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原液2~14 倍，编为2-14 号（表4.1）。将配好的14 种浓度的PTC 溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过的100 ml 螺口试剂瓶中。6另取娃哈哈纯净水作为第15 号液。

PTC溶液梯度的配置

编

号

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

浓度1/X 75

150

300

600

120

00

240

00

480

00

960

00

192

000

384

000

768

000

153

600

307

200

614

400

纯

净

水

1.2 PTC尝味

（1）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴2～3 滴15 号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下反复咂嘴品味液体尝味，然后用纯净水做同样的试验，交替给受试者尝味，避受试者的臆意猜测而影响结果的准确。

（2）询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。

（3）若不能鉴别或鉴别不准，则依次用14~1 号溶液重复试验，直到能明确鉴别出PTC 的苦味为止。

（4）复尝味3 次，3 次结果相同时，才是可靠。

（5）记录所品出苦味的液体的编号和稀释浓度。

1.3 基因型测定

1.3.1 人口腔上皮细胞总DNA提取

1.3.1.1 主要仪器设备

高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、涡旋振荡器、高速离心机、恒温振荡摇床、微量移液器、电磁炉、冰箱、-80℃超低温冰箱、计时器、pH 计。洁净、经121℃高压灭菌20min 的量筒、烧杯、螺口试剂瓶、牙签、1.5 mL灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌PE 手套、乳胶手套、口罩，记号笔。

1.3.1.2 试剂和材料

（1）材料：每实验小组选取1 名受试者，用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。

（2）试剂：灭菌水，pH 标准液，细胞基因组DNA 提取试剂盒。

1.3.1.3 实验方法

（1）在1.5 ml 灭菌微量离心管中加入100 µL 灭菌水。

（2）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在灭菌水中漂洗。

（3）涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s，

（4）离心机瞬时离心10 s。

（5）沸水浴中煮沸5 min。

（6）离心机13200rpm 离心2 min。

（7）基因组DNA 4˚C 保存备份。

1.3.2 PCR扩增PTC片段

1.3.

2.1 主要仪器设备