受体与配体结合试验的测定方法

【实验原理】
• 总结合管：将放射性配基与受体制备物反应，除去游离的 放射性配基，测定结合的放射性配基的计数，（其中包含 特异性结合与非特异性结合，称为总结合）。 • 非特异性结合管：将大量（一般为500－1000倍）非标记 特异性配基与标记的放射性配基相混，然后共同与受体制 备物反应。由于非标记配基与标记配基两者比例悬殊，所 以受体几乎全部被非标记配基饱和，标记配基只能与组织 制备物中的非特异结合位点结合。这时测出的标记配基的 结合量，反映的是非特异结合量。用总结合管的计数减去 非特异结合管的计数，即可得到特异结合计数。
【结论】
• 与受体结合的最大配基量为XXXX nM，即 脑P2部分样品受点的含量－最大结合量： XXXX nM。 解离常数KD为XXXX。
【参考文献】
• Mary J. Mycek, Richard A. Harvey, Pamela C. Chample. Lippincott Illustrated Reviews Pharmacology. Philadelphia: Lippincott Willams & Wilkins, 2002. 张德昌主编. 《医学药理学》. 北京：北京医科 大学中国协和医科大学联合出版社，1998. 《药理学实验讲义》. 中国协和医科大学药理 室, 2005年10月 左萍萍老师的课件
【实验结果与分析】
绘图： （1）饱和曲线：见图4 • B为纵坐标，F为横坐标，计算出总结合，非特 异结合，特异性结合，作图即可得到受点结合 曲线。 （2）Scatchard作图：见图5 • B/F为纵坐标，B为横坐标绘制Scatchard图形， 所得图形为双曲线，用电子计算机绘图，找出 渐近线，分别算出高低亲和力结合的最大结合 数量KD值。
• • •
【实验结果与分析】
实验数据处理和计算 （1） 各管中自由标记配基的浓度F： • 由测定到的最高计算以1：0.7比例稀释后各种浓 度标记配基的放射计数，从中减去总结合计数， 即得管中游离的标记配体的计数，并换算成配基 的浓度。 • 由于C1V1=C2V2，可得：F=相应浓度×（总计数 －总结合量）/总计数 （2）特异性结合SB计算： • 总结合管减非特异性结合管的计数即为特异性结 合计数，并换算成配基浓度。 • S=T－N；B=相应浓度×特异性结合量/总计数。
【实验原理】
图2
一个配基一种受体情况下的Scarchard作图
【实验原理】
• 以B/F与B作图，可得到一条直线，即Scarchard作 图（如图2）。若放射性配基稀释成不同浓度 (F)，与受体制备物作用后，分别测得相应的结合 配基量，即可绘出上图，从而求得Bmax及 KD。 由图2可分析受体的属性以及求得Bmax值。 • 以上是一个配基一个受体的情况，若受体具有亲 和力不同的两种以上的结合点，则Scatchard图是 曲线。例如当有高低两种亲和力结合点时， Scatchard图是双曲线。其两个渐近线分别代表高 低亲和力两种结合点的图形，并可通过计算求 出，从而求得相应的Bmax及KD。如图3所示。
【实验方法】
2. RRA实验加样： • RRA实验加样，依表中所列顺序加入试管。P2制 备物最后加，每个测定点都取双复管平行实验。 • 每个配基浓度有4管，两个总结合管T（取平均 值），两个非特异性结合管N（取平均值）；做6 个浓度（见表2），所以共有24管，注意加样顺 序，见表1：
【实验方法】
表1 RRA实验加样表
加样 总结合T 非特异结合管N
Tris－HCl 0.1ml /
纳洛酮 / 0.1ml
3H－纳洛酮
P2 0.3ml 0.3ml
0.1ml 0.1ml
【实验方法】
3． 分离与液闪测定： • 加样完毕，样品试管混合均匀后，置于30℃室 温下保温30分钟，冰上终止反应。到 454号房间 抽滤（以GF/B或国产滤膜7901过滤，滤膜用 Tris液浸润，光面向上，毛面向下，5ml冷 buffer，洗涤2次）。取下膜，滤膜放入闪烁 杯，每管加 8ml闪烁液，进行液闪测定。
【实验原理】
图3
有高低两种亲和力受体结合点时的Scatchard图
【实验材料】
• 纳洛酮：25μM水溶液； • 3H 依 托 啡 ： 原 液 的 放 射 比 活 性 为 44ci/mmol ， 1mci/ml配成4.9nM，按1：0.7的比例依次稀释， 配制6个浓度的工作液，其浓度依次为：4.9nM， 3.43nM，2.4nM，1.68nM，0.82nM，0.4nM； • 甲 苯 闪 烁 液 ：PPO1.5g，POPOP300mg加甲苯至 3000ml • 50mMTris－HCl buffer pH7.5
【实验原理】
• 放射配基与受体制备物（含受体的组织或细胞制 备物）作用时，其结合形式有两种，一种是配基 与受体的特异性结合，其特点是亲和力高；且由 于受体有限，故具有饱和性。另一种是配基与受 体制备物的非受体分子的结合，称为非特异性结 合。其特点是亲和力低但结合点多，不易饱和。 用放射性配基研究特异性受体时，必须设法减除 非特异性结合。一般采用的方法是制备总结合管 和非特异结合管，两者计数之差即为特异性结合 量。
பைடு நூலகம்
【实验方法】
1. 脑P2部分（吗啡受体粗膜）制备：（实验老师事 先已完成） • 大鼠断头处死，取出全脑，弃去小脑，清除表面 的脑膜及血管。称重后加10倍体积Tris-HCl溶液， 用玻璃匀浆器研碎，制成10％匀浆。4℃，1000g 离心10分钟，弃去沉淀。上清离心16000g，4℃20 分钟后保留沉淀。加50mM Tris-HCl缓冲液混悬 均匀，30℃保温30分钟，以去除内源性阿片样物 质，再次离心16000g，4℃20分钟。保留沉淀并将 其混悬于50mM Tris-HCl缓冲液中。使其蛋白浓度 为16.7mg/ml，然后分装，置－20℃冰箱保存备用。 此制备物即为阿片受体粗膜（P2）。
【实验原理】
【实验原理】
• 组织制备物中的受体含量及解离常数的计算：设 想如果放射性配基浓度足够大，受体全部被其结 合，这时的放射性配基的结合量即反映出受点含 量，我们将其称为最大结合量，以Bmax表示。若 以B代表与受体结合的配基量，F代表配基浓度， KD代表解离常数，根据Clark受体理论： • B＝Bmax•F/(F＋KD) B与F作用是一条直角双曲 线 • 将B＝Bmax•F/(F＋KD)变形得： B/F＝Bmax/ KD －B/ KD
【实验结果与分析】
图4 放射受体结合实验数据饱和曲线
饱和曲线
配基结合浓度/cpm
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5
N S T 对数 (S) 对数 (T) 线性 (N)
F/cpm
注：T, N,S分别为总结合，非特异结合，特异性结合计数，横坐标F为游 离配基浓度。
【实验结果与分析】
表3
总计数 /cpm 相应浓度 /nM 总结合T /cpm
放射受体结合实验数据表
非特异结合N /cpm 特异结合S /cpm 游离配基 浓度F/nM 特异结合的配 基浓度B/nM B/F
注：T、N值由实验测得，为两次测量值的平均，S = T－N； 由于C1V1=C2V2，可得：F=相应浓度×（总计数－总结合量）/总 计数，B=相应浓度×特异性结合量/总计数
【实验结果与分析】
表2 放射受体结合实验原始数据表（单位：cpm）
T1 T2 T ave N1 N2 N ave
注：T1, T2分别为总结合量的两个平行测定值，Tave为总结合量的平均值，即 （T1 + T2）/2。类似的，N1, N2分别为非特异结合量的两个平行测定值，Nave 为非特异结合量的平均值，即（N1 + N2）/2。
中国协和医科大学药理学实验
放射配体受体结合实验
Radio-ligand Receptor Binding Assay
中国协和医科大学药理学系 叶菜英
【实验目的】
• 学习放射配体受体结合（RRA）的基本方法； • 观察了解受体与配基的结合作用。
【实验原理】
• R+L≒RL*+L为本实验的基本反应。其中R代表受体，L代 表配基，RL*代表受体配基复合物。 • 药物与受体结合位点间的相互作用，遵守质量作用定律。 利用不同浓度的放射性配基与一定量的受体结合，即可以 用数学作图推导出受体含量，并计算出解离常数作为受体 与配基亲和力的一个指标。本实验用氚标记的纳洛酮 （naloxone ，Nx）来研究阿片受体及其配基的结合情况， 计算出受体含量及解离常数，分析有多种不同亲和力的受 体存在时配基与受体的作用规律。
【实验结果与分析】
图5 放射受体实验数据Scatchard作图
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.05
y = -1.1668x + 0.4625 R 2 = 0.644
B/F
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
B/cpm
【实验讨论】
• 实验方法讨论 • 实验操作讨论 • 实验结果讨论