实用病毒学检测技术.pdf

病毒感染的初步鉴定
病毒的大小和形态：可用电子显微镜观察病毒的 大小及形态，或用超微过滤法估计病毒颗粒的大 小。 核酸类型鉴别： 5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）可抑 制DNA复制，而对RNA病毒无作用，利用此特性 可判断病毒核酸类型。
疱疹病毒 烟草病毒
病毒感染的初步鉴定
耐酸试验： 肠道病毒和鼻病毒都是小RNA病毒， 但肠道病毒对酸（pH3）耐受，鼻病毒在酸性条 件下易灭活，藉此可区别。 乙醚敏感试验：包膜病毒包膜易被乙醚、氯仿、 脱氧胆酸钠等脂溶剂溶解，而失去感染性，可作 为病毒是否具有脂类 包膜的依据。
二倍 人胚肺成纤维细胞株 体
HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒 HIV、HTLV、HHV-6 腮腺炎病毒、腺病毒 ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、RSV CMV、VZV、鼻病毒 腮腺炎病毒、腺病毒 柯萨奇A、B组、RSV 腺病毒、RSV HSV、RSV、风疹病毒 、轮状病毒、麻疹病毒
WI-38、MRC—5 Hela
标 本 采 鸡胚培养 集 （粘液V、疱疹V、痘类V） 与 运 动物实验 送 （新生小鼠、乳鼠） 细胞培养 （原代、传代细胞系）
初步鉴定 病毒分离
血清学 最终鉴定
豚鼠
标本的采集和运送
尽早(疾病初期或急性期)采集适当部位的标本 立即接种或冷藏送检或加 入甘油或二甲亚砜-70℃保存 采双份血清：急性期和恢复期各一份，同时测抗 体，效价呈4倍以上增高有诊断价值 烈性病毒严防扩散， 专人送检 应填写病人详细信息， 便于流行病学调查
病毒感染的快速诊断－形态学检查
光镜检查： 根据病毒感染细胞内嗜酸性或嗜碱性 包涵体的特点辅助判断。 电镜检查： 感染早期的标本中可直接检出病毒体 （HAV、轮状病毒） 方法学评价：直接检测 标本、发现新病毒、直 观显示病毒，用于检测 极难分离的病毒。但仪 器昂贵，技术高，不能 鉴别病毒的血清型。
电子显微镜
/sps
实用病毒学检验技术
REVIEW ON PRATICAL VIROLOGY ASSAY
湖南省食品质量监督检测所
病毒概述 Virus
非细胞形态、微小，只含RNA或 DNA，严格活细胞寄生，以复制 AIDS患者 方式增殖 人类传染病中约80%为病毒， 传染性强流行广，少有特效药物 与肿瘤的发生密切相关 比病毒更小的传染因子 有卫星病毒、 类病毒 和朊粒等。 朊病毒
病毒感染的最终鉴定
在初步鉴定的基础上选择适当的血清学方法 对病毒分离株进行最后鉴定，病毒＋已知参考血 清反应。 中和实验：病毒与型特异性抗体进行免疫反应 后，使之不能吸附于敏感细胞，失去感染能力 补体结合实验：补体结合抗体为IgM，出现早， 消失快，可用于病毒感染的早期诊断。
病毒感染的最终鉴定
血凝及血凝抑制试验 ：病毒或其血凝素在一定 PH和T可与RBC产生血凝，这些性质有重要鉴定 意义。加入相应的血凝素抗体则可抑制血凝以鉴 定型别。 免疫荧光抗体技术：出现明显CPE前检查病毒 Ag，以作为早期快速诊断以及无CPE病毒。特异 荧光抗体染色后荧光显微镜观察，判断型别。 酶免疫技术：ELISE
免疫荧光：荧光素标记的抗体直接或间接测定病 毒抗原 免疫过氧化物酶技术 ：偶联物是辣根过氧化物酶 酶免疫 乳胶凝集试验 放射免疫技术（RIA） 发光免疫技术 金标免疫技术等
SARS病毒的免疫荧光染色检测
快速诊断－核酸检测
斑点杂交法 （Dot blot hybridization）： 大多数病毒核酸和PCR产物 转印杂交： Southern 、Northern 原位杂交： 胞内病毒检测和定位。 固相杂交技术： 核酸修 饰后包被微孔板，加入待测的核酸序列和标记探 针。 聚合酶链反应（PCR）：特异、敏感 RT-PCR, RealTime PCR
快速诊断－血清学诊断
中和试验、补体结合、RBC凝集及凝集抑制、红 细胞吸附和吸附抑制试验、免疫荧光技术、免疫 酶染色、ELISA、Western blot、化学发光、时间 分辨免疫荧光、荧光偏振、胶体金等属血清学范 畴。
垂直电泳仪
Western blot电泳图
病毒检验的结果评价
通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据， 从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病 毒实验诊断的目标。 通过分离和鉴定获得致病性病毒，发现病毒感染的特 异征象，如特异性抗体,急性期和恢复期血清中相应 的特异性抗体有 4倍以上的升高，细胞内包涵体的 形成等,就可得出病原学诊断。 感染病毒的临床意义必须结合流行 病学资料、临床表现、病毒种类及 机体的病理变化作综合分析，才能 判定。
单纯疱疹
HBV感染分布↑
病毒的结构、化学组成与功能
基本结构由核心(Core)和衣壳(Capsid)组成,核心＋ 蛋白质＝核衣壳（Nucleocapsid） 有些病毒在衣壳外有一层类脂包膜（Envelope）表 面常有不同形状突起， 称刺突（Spike） 病毒主要成分 为核酸、蛋白质、 脂类和糖类
病毒感染的检验流程
快速诊断－抗原检测
免疫学方法检测标本中特异性抗原，可早期诊断 病毒感染。用单克隆抗体检测病毒抗原，具有良 好的特异性。 常用方法：组织或胞内的病毒成 分可用免疫荧光染色、免疫酶染 色等；胞外的或可溶性的病毒成 分可用凝集试验、酶联免疫 吸附试验、放免、免疫渗滤 层析试验 （胶体金）等。
快速诊断－抗原检测
病毒感染的快速诊断
传统的单一分离病毒已经发展至病毒血清 学、分子生物学、电子显微镜等更加敏 感、特异、简便的诊断技术。 病毒感染的快速诊断有利于已有特异药物 病毒感染的治疗，如疱疹病毒。 早期诊断对控制病毒感染十分重要。确诊 病毒感染的病原在监测病毒的流行病学也 有重要的意义。 形态学、Ag检测、核酸、血清学
嗜酸性病毒包涵体
RSV感染后Hela 细胞的融合病变
病毒感染的初步鉴定
蚀斑形成：单层细胞中被病毒感染导致死亡的细 胞区叫空斑，一个空斑由一个病毒颗粒感染引起 的。病毒不同则空斑形态和大小不同。 干扰现象：病毒间可互相干扰，一种病毒感染细 胞后，可以干扰以后进入的病毒增殖。 红细胞吸附及抑制试验： 某些病毒感染的细胞表 面含血凝素可与RBC吸 附，加入抗体后可抑制。
标本处理与接种
标本的处理 ：除去标本中的 污染细菌，并将其中的病毒 培养瓶、培养板 释放至细胞外 细胞培养:原代和次 代细胞培养 、二倍体 细胞 、传代细胞系 培养基：1640、 DMEM、 MEM
CO2细胞培养箱
倒置显微镜
常用于病毒分离的细胞
非洲绿猴肾细胞 原 代 细 胞 人单核细胞 人胚肾、肺细胞 恒河猴猕猴肾细胞
请多指教，谢谢！
20ero
病毒感染的初步鉴定
自细胞培养、鸡胚或动物分离出的能稳定传代的 病原，在确证无细菌、支原体污染后，就可以认 为已分离到病毒。 初步鉴定：临床症状、流 行病学、标本来源、 易感动物、细胞病 变、生物学特征、理 化特征等。
病毒感染的初步鉴定
细胞病变效应 (Cytopathic effect ) 由病毒增殖引起的细胞改变 ①圆缩、分散、溶解 HCMV感染HEL细胞 后的巨细胞病变 ②融合成多核巨细胞 ③肿胀、颗粒增多、 聚集成葡萄状 ④胞质出现空泡 ⑤胞浆或核内出现 嗜酸性或嗜碱性包 涵体 ⑥培养液pH的变化