不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因关系的研究

不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因关系的研究

本研究以实时荧光定量TagMan-PCR和原代培养猪回肠上皮细胞技术，研究了不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因的关系。研究包括六个试验。

试验一猪拟杆菌属-普雷沃氏菌属16SrDNATagMan-PCR实时荧光定量PCR方法建立通过对猪肠道30种细菌的16SrDNA序列进行比对分析，设计拟杆菌属—普雷沃氏菌属荧光定量的特异引物；以多形拟杆菌菌株（CDC1404-A）基因组的DNA为模板，用常规PCR引物扩增16SrDNA靶片断，将PCR产物纯化后作为DNA 标准品，按1.19×10²—1.19×10⁶copies／ul 5个稀释梯度的标准品作模板，建立定量标准曲线：用TaqMan探针建立25ul反应体系，对不同浓度的多形拟杆菌DNA样品进行检测，检测探针的敏感性；并以乳酸杆菌、大肠杆菌和双歧杆菌的基因组DNA模板作阴性对照，检测拟杆菌属—普雷沃氏菌属的特异性。结果表明：1)通过克隆测序，得到了拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌的16SrDNA部分共有片段序列，该序列与Genbank中发表的多形拟杆菌（基因序列号为M58763）和中间普雷沃菌（基因序列号为AY323522）16SrDNA基因序列相比，该片段为多形拟杆菌的792～1003和中间普雷沃菌的763—974位碱基的片段，同源性分别为92％和94％。

2)25ul PCR反应体系中Mg²⁺的最佳工作浓度均为5.0mM，探针最佳工作浓度为0.2μm，Taqman探针敏感性为3.73个／ul；3)本试验所制作的标准品稀释度在1.19×10²—1.19×10⁶copies／ul范围线性关系良好，标准品可用于后续试验的研究。试验二不同品种猪肠道微生物与体脂的关系试验通过选用在同一条件下饲养的0、1、2、3、4和5月龄的长白和太湖猪各4头，屠宰取后回肠和盲肠内容物，检测1、3和5月龄长白和太湖

猪回肠和盲肠内容物的总细菌、革蓝氏阳性细菌（Gram positive bacteria，

G⁺）、革蓝氏阴性细菌（Gram negativebacteria，G^-）、革蓝氏阳性细菌／革蓝氏阴性细菌（G⁺／G^-）、拟杆菌属-普雷沃氏菌属（Bacteroides-Prevotella, B. P）细菌数量、背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪。

结果表明：1)太湖猪的回肠和盲肠内容物的G^-及B．P细菌数量在不同年龄阶段均显著（p＜0.05）高于长白猪，G⁺／G^-极显著低于（p＜0.01）长白猪，总细菌、G⁺与长白猪无显著差异（p ＞0.05）。2)猪回肠和盲肠的B．P和G^-数量都与背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪都有正相关关系，而G⁺／G^-比例与背膘厚度、脂肪率、脂肪细胞直径和肌内脂肪有负相关关系。

试验三猪ANGPTL4基因的克隆及其实时荧光定量TaqMan-PCR检测方法的建立为了对ANGPTL4基因进行更为准确定量，本研究首先克隆长白和太湖猪的ANGPTL4和β-actin的DNA序列。根据所测定的序列，分别设计引物和探针，以回肠基因组的cDNA为模板，用常规PCR引物扩增，将PCR产物纯化作为DNA标准品，ANGPTL4和β-actin基因标准品分别按1.37×10⁴－1.37×10⁹和8.31×10⁵－8.31×10¹⁰copies／mL的稀释梯度建立定量标准曲线，以TaqMan探针建立25ul反应体系，优化探针的最佳工作浓度，并检测探针的灵敏度。

结果表明：1)应用克隆测序方法获得了长白和太湖猪的目的基因ANGPTL4

和内参基因；β-actin的部分序列，所获得的长白和太湖猪的ANGPTL4的片断与参照序列（AY751522）的同源性分别为98％和92％，而B-actin与参照序列

（U07786）的同源性都为98％。2)ANGPTL4和β-actin探针在25ul体系中的最佳工作浓度分别为0.35μM和0.40μM，探针的灵敏度分别为13.7和83.1拷贝／ul；3)所构建的ANGPTL4和β-actin的标准曲线良好，反应体系中分别含有1.37×10⁴－1.37×10⁹和8.31×10⁵－

8.31×10¹⁰copies／mL时，扩增反应ct值与拷贝数的对数呈线性关系，所得标准品可以用于后续试验。

试验四ANGPTL4基因在猪不同组织器官中的表达差异试验通过选用在同一条件下饲养的4月龄长白和太湖猪各4头，屠宰后取肝脏、脂肪、心脏、空肠、回肠、盲肠和结肠。根据试验三克隆的长白和太湖猪的ANGPTL4基因的序列，采用半定量RT－PCR技术检测ANGPTL4在不同品种组织中的表达差异。

结果表明：1)猪ANGPTL4基因在肝脏、脂肪、心脏、小肠和大肠四种组织中都有表达，其中在脂肪组织的表达最丰富，其次是肝脏、大肠、心脏、小肠。2)太湖猪的脂肪和肝脏组织ANGPTL4基因相对表达量都极显著（p＜0.01）高于长白猪，回肠和空肠中ANGPTL4基因表达量极显著低于（p＜0.01）长白猪，盲肠、结肠、心脏中ANGPTL4基因表达量与长白猪无差异（p＞0.05）。

试验五不同品种猪回肠微生物与ANGPTL4基因的关系选择0日龄健康正常的太湖猪和长白猪各24头进行150天的试验。每个品种设为一个处理，每个处理按体重一致原则设4个重复，公母各半，每个重复6头猪。

在同一环境条件下饲予相同的饲粮，分别在0、1、2、3、4、5月龄，每种猪各屠宰4头，测定回肠中ANGPTL4基因表达量和拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌数量。结果表明：1)1-5月龄的太湖猪回肠拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量均高于长白猪，特别是在2、3和5月龄，极显著（p＜0.01）高于长白猪。