杂交鹅掌楸体胚发生过程的起源及发育过程_陈金慧

的一些核质比大的单细胞发育成单细胞原胚，单细胞原胚有厚壁包围，呈生理隔离状态，后经过
细胞分裂建立极性，细胞分裂经过球形胚、心形胚、鱼雷胚最后发育有茎段、根端及 V 形维管束
系统的成熟子叶胚。
关键词： 杂交鹅掌楸； 体细胞胚； 发育
中图分类号： S722； Q813
文献标志码： A
文章编号： 1000 － 2006（ 2012） 01 － 0016 － 05
组织学观 察 表 明，非 胚 性 细 胞 为 薄 壁 组 织 细 胞，非胚性愈伤边缘的细胞通过活跃的有丝分裂活 动进行快速的细胞分裂和增殖，可以转化为胚性愈 伤组织细胞（ 图 2B） 。
胚性细胞的一个显著特征就是核质比较大，胚 性细胞体积较非胚性细胞小，细胞圆形，细胞质浓 厚，细胞核大、位于细胞中央，细胞内通常积累大量 的营养物质，为胚胎发生做好物质准备 （ 图 2C） 。 这与张书标等［8］在花生体胚的研究中发现花生胚 性愈伤组织的细胞具有细胞小、胞质浓、核大、核仁 明显、排列紧密特点的研究结果类似。
2． 3 杂交鹅掌楸体细胞胚的起源及发生部位 在杂交鹅掌楸的研究中发现，体细胞胚往往是单
细胞起源，体细胞多数在胚性愈伤组织的表面发生 （ 图 3A） ，极少在愈伤组织的内部发生，在体视镜下观 察，可以看到胚性愈伤的表面细胞特别亮，可能在进 行着体细胞胚胎发生过程（ 图 3B） 。早期原胚细胞大 而圆、细胞核也较大、核仁清晰可见、细胞质浓厚、细 胞壁厚，从而将胚性细胞与周围愈伤组织细胞隔离开 来，早期原胚内积累大量的淀粉粒，所以淀粉粒的积 累可以作为体细胞胚胎发生的早期标记（ 图 3C） 。随 着培养条件的优化，体细胞胚胎发生能力逐渐增强， 体细胞原胚成团出现且处处可见（ 图 3D） 。 2． 4 杂交鹅掌楸体细胞胚的发育过程
Study on origin and development of somatic embryos of Liriodendron hybrids
CHEN Jinhui，ZHANG Yanjuan，LI Tingting，WANG Pengkai，WANG Guangping，SHI Jisen*
（ 南京林业大学森林资源与环境学院，林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏 南京 210037）
摘要： 以杂交鹅掌楸体细胞胚为材料，利用细胞学技术研究杂交鹅掌楸体细胞胚的起源及发育过
程。结果表明： 以杂交鹅掌楸未成熟胚为材料，比较容易形成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织细胞
结构致密、胚性细胞小、直径相等、细胞质浓厚，细胞内大量积累淀粉等物质，胚性愈伤组织表面
Abstract： This research was mainly to discover the origin and development of somatic embryos of Liriodendron hybrids with cellular observation． The results showed that embryogenic callus can be easily induced when used immature zygote embryo as explant． The embryogenic callus structure was tight and compacted and embryogenic cells were small，isodiametric and densely cytoplasmic，with a high nucleoplasmic ratio and small starch grains． Some single-cells from the surface of embryogenic callus can grow into single-cell proembryo with thick cell wall，which show they are independent at the beginning of their lives． The significant character of the somatic embryo was its polarity． Plantlet regenerations were developed from global embryo，heart-shaped embryo，torpedo-shaped embryo and cotyledon embryo，in which the V-shaped vessel vascular bundles，shoot tip meristem and root tip meristem were observed． Key words： Liriodendron hybrids； somatic embryos； development
形态观察的实验材料于奥林巴斯体式显微镜 下进行表面形态观察，佳能数码相机拍照。
显微观察的材料经 FAA（ 50 % 酒精配制） 固定， 系列酒精脱水后以二甲苯过渡到石蜡（ 52 ～ 54 ℃ ） 并包埋。820 型旋转式切片机切片，厚 6 ～ 8 μm， Haupt 粘贴剂粘片，经烤片、烘干后，脱蜡并下行酒 精系列复水至番红（ 0． 5 % ，35 % 酒精配制） 中染色 过夜，再系列酒精脱水到固绿（ 1 % ，95 % 酒精配 制） 30 s，苦味酸分色，酒精脱水，二甲苯透明，中性 树胶封片，日产奥林巴斯显微镜观察、拍片。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
17
取材以进行进一步的研究。因此，利用杂交鹅掌楸 体细胞胚 胎 发 生 体 系［6］，可 以 系 统 研 究 胚 性 细 胞 的起源和发育。在前期研究中，笔者曾用扫描电镜 技术对 体 胚 发 生 过 程 及 体 胚 结 构 进 行 了 系 统 观 察［7］，该研究 将 从 组 织 细 胞 学 水 平 对 胚 性 细 胞 的 起源和发生途径进行深入的探讨，为体细胞胚胎发 生体系的建立提供细胞水平的证据，揭示体胚发生 的机制。
个月 的 增 殖 分 化，会 出 现 较 多 的 体 细 胞 胚 （ 图 1D） 。将发育良好的子叶胚挑出来继代到萌发培 养基上进一步发育，从而能够实现胚状体有效的萌 发、生根与成苗（ 图 1E、1F） 。
1 材料与方法
1． 1 供试材料 分别取不同发育时期的杂交鹅掌楸胚性材料，
包括非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织及各个发育阶 段的体细胞胚。 1． 2 制备方法及形态观察
（ Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology of Ministry of Education，College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）
2 结果与分析
图 1 杂交鹅掌楸愈伤组织的诱导 Fig． 1 Callus induction of Liriodendron hybrids
注： A． 非胚性愈伤组织； B． 非胚性愈伤组织； C． 胚性愈伤组 织； D． 体细胞胚； E． 子叶胚； F． 再生植株。
2． 1 杂交鹅掌楸外植体的反应 杂交鹅掌 楸 愈 伤 组 织 诱 导 速 度 极 快，接 种 后
体细胞胚胎发生技术自从 19 世纪 60 年代建 立以来，不仅成为植物快速繁殖的最重要的手段之 一，而且已发展成为植物胚胎发生机制研究的重要 手段［1］。植物体细胞胚胎的不同发生途径或起源 方式直接关系到体细胞胚胎发生技术的适用范围。 利用细胞生物学手段，研究体细胞胚的发生途径和 起源方式不仅有助于理解植物细胞全能性的表达 过程，也是 发 展 植 物 遗 传 和 细 胞 工 程 技 术 的 现 实 需要。
将要进行分裂的单细胞原胚细胞内积累营养物 质，细胞体积增大。多数单细胞原胚一般经一次不均 等分裂形成两个细胞，一个为胚细胞，将来发育成胚， 一个为胚柄细胞，将来发育成胚柄 （ 图 4A） ； 也有的单 细胞原胚第 1 次细胞分裂为均等分裂，在接下来的细
图 3 体细胞胚的起源与发生部位 Fig． 3 Position of the origin and development
收稿日期： 2011 － 05 － 03
修回日期： 2011 － 09 － 16
基金项目： 国家自然科学基金青年项目 （ 30901156 ） ； 国 家 林业局“948 ”引 进 项目 （ 2009 － 4 － 24 ） ； 江苏高校自 然 科 学 基 金 项 目
（ 09KJA220001） ； 江苏省高校优势学科建设工程资助项目
胚性愈伤组织具有较强的体细胞胚胎发生能 力，将其继代到胚性愈伤增殖培养基上，经过 1 ～ 2
2． 2 杂交鹅掌楸胚性愈伤组织细胞与非胚性愈伤 组织细胞的差异
通过石蜡切片法，在显微镜下观察胚性细胞与 非胚性细胞，发现非胚性细胞通常较大，形状不规 则，细胞核小、位于细胞边缘，细胞质稀薄，细胞壁 薄，细胞含水量大，往往会因为制样过程中的脱水 作用而变形（ 图 2A） 。
第 36 卷 第 1 期 2012 年 1 月
南京林业大学学报（ 自然科学版）
Journal of Nanjing Forestry University （ Natural Science Edition）
Vol． 36，No． 1 Jan． ，2012
杂交鹅掌楸体胚发生过程的起源及发育过程
陈金慧，张艳娟，李婷婷，王鹏凯，王光萍 施季森*
10 d 在外植体的边缘就开始有愈伤组织形成，培 养较短一段时间以后，来自于幼胚的细胞（ 图 1A、 1B、1C） 受到激素及培养环境的作用而开始形成胚 性愈伤组织。经过多次继代培养可形成 3 类愈伤 组织： 第 1 类愈伤组织质地坚硬，生长缓慢，生活力 较低，不能诱导体胚，属非胚性愈伤组织（ 图 1A） ； 第 2 类是白色透明蓬松状愈伤组织（ 图 1B） ，该类 型的愈伤组织随着继代次数的增加，愈伤会不断快 速生长，迅速消耗培养瓶内的养分和水分，一定时 间后培养基甚至出现开裂现象，同时此种类型的愈 伤并不具备胚胎发生的能力，为非胚性愈伤组织； 第 3 类呈白色或淡米色、光泽度好、细胞活力强颗 粒状，生长速度适中，在合适的条件下，能够进一步 发育成体细胞胚，属于胚性愈伤组织（ 图 1C） 。
在木本植物体胚发生的机制研究中发现，多数 体细 胞 胚 是 单 细 胞 起 源 的，如 在 栓 皮 栎［2］、油 棕［3］、栎树［4］的 研 究 中 发 现 体 细 胞 胚 直 接 起 源 于 胚性细胞团表皮或近表皮的单细胞。悬浮培养的 枸杞细胞就是先分裂成细胞团，再由一些胚性细胞 团发育形成一个或几个胚状体［5］。南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 建立的杂交鹅掌楸体细胞胚发生体系具有数量多、 分化系数高的特点，各个发育阶段清晰可辨，容易
18
南京林业大学学报（ 自然科学版）
第 36 卷
图 2 胚性与非胚性愈伤组织细胞差异 Fig． 2 Difference between embryogenic and
non-embryogenic callus
注： A． 非胚性愈伤组织，× 100； B． 非胚性愈伤组织边缘逐 渐分化出胚性愈伤组织，× 100； C． 胚性愈伤组织细胞内积累大 量营养物质，× 200。
of somatic embryos
注： A． 胚性细胞的单细胞起源，表面发生，× 100； B． 单个 胚性细胞，× 100； C． 单个胚性细胞，淀粉粒丰富； D． 体细胞胚 成团出现，增殖系数高，× 200。
第一作者： 陈金慧，副教授，博士。* 通信作者： 施季森，教授。E-mail： jshi@ njfu． edu． cn。
引文格式： 陈金慧，张艳娟，李婷婷，等． 杂交鹅掌楸体胚发生过程的起源及发育过程［J］． 南京林业大学学报： 自然科学版，2012，36
（ 1） ： 16 － 20．
第1 期
陈金慧，等： 杂交鹅掌楸体胚发生过程的起源及发育过程