基因克隆PPT课件

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构成:质粒复制起始点、一个或多个限制性 内切酶位点、抗药性基因、λ噬菌体的cos位 点。粘粒载体大小为4~6kb。
1载体(vector)
携带靶DNA片段(外源DNA片段) 进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
宿主细胞,常见的有大肠杆菌、酵母等。
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2载体的特征:
能自主复制;
具备筛选标记;
适当大小的分子量和适当限制性内切酶 酶切位点;
在细胞中拷Βιβλιοθήκη Baidu数高
除上述特征外,表达载体还应配备有与 宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、 加尾信号、增强子等调控DNA元件。
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3 插入载体
经人工改造而成,具有单一的 EcoRⅠ 酶 切 位 点 , 该 酶 切 位 点 位 于 lacZ基因内,使用蓝白斑筛选法。插入 片 段 长 度 约 几 个 kb , 主 要 用 于 构 建 cDNA文库。
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插入载体的 筛选原理
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4 替代载体
λ噬菌体基因组中央部分约有14kb主要 编码抑制性因子,非裂菌性生长所必需, 作为载体这部分可被外源DNA所替代。
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3 载体的分类
按来源分:质粒、噬菌体、病毒载体等; 按用途和功能分:克隆载体和表达载体。
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克隆载体与表达载体
克隆载体:主要用来获得大量纯化的目的DNA 片段(目的基因),以便进一步研究其结构和 功能;本章主要以克隆载体为例讲解。 表达载体:主要用来产生插入基因和mRNA, 进而合成相关蛋白质。
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此载体中央部分两端有三个酶切位点。可插 入片段的长度约9~22kb,主要用于构建基因 组文库。
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不足:
λ噬菌体载体在进行真核基因组文 库构建时,其容量仍然受到一定的限 制。最大插入片段不能超过23kb。
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四、粘粒载体
1978年构建,由质粒和噬菌体的cos粘 性末端构建而成。插入片段29~45kb。 可根据载体携带的抗药性标记筛选阳性 克隆细胞株。
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λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式:插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后,还不能直接 转染宿主细胞,必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力,重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装,除必须含有cos位点 外,就是对重组DNA分子长度有严格的限制,必须不能大 于野生型基因组长度的105%或小于75%,否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒,因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15~25kb。
外源基因插入载体后,lacZ被破坏,不能分解 X-gal,菌落呈白色。——“蓝白斑”筛选法。
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7质粒载体的主要用途
保存和扩增片段小于2kb的DNA; 构建cDNA文库; 目的DNA测序; 制备探针。
缺点:所能接受的DNA片段容量小;转化效率低。
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三、λ噬菌体载体
λ噬菌体的基因组是约50kb的线性双链 DNA分子,两端各有12个核苷酸的5’突 出,碱基互补(cos位点,又称粘端)。 λ噬菌体感染宿主菌后,其粘端通过碱基 配对而结合,形成环状DNA分子。
Selectable marker, such as drug resistance
Insertion site for foreign DNA
(often a genetically engineered multiple cloning region with sites for several restriction enzymes)
(1)构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体,长2674bp,1983年构建。
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主要特点:氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点(ori)
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(2)筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 (lacZ基因),编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补(α互补),形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal,形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 (2).载体
心血管病研究所 王佐
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一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志,如果 将其导入宿主细胞,没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后,不能随宿主细 胞的繁殖而复制,达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
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质粒复制与细菌复制 的关系
密切
能在没有蛋白质合成 的情况下继续复制
在基因克隆中的应用 前景


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3 Specificity of Plasmid Vectors
Autonomously replicating DNA molecules
(have an origin of replication)
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multiple cloning sites
人工合成的DNA序列,含有密 集排列的多种限制性内切酶识别 序列,以利于不同来源的外源 DNA片段插入载体。
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pBR系列载体
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4 pBR质粒载体筛选的原理
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5 pBR质粒载体的筛选方法——双抗生素对照筛选法
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6 pUC系列载体
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1λ噬菌体在细菌内的生长方式:
裂菌性生长(lytic pathway):在宿主菌中大 量复制并组装成子代噬菌体颗粒,导致宿主菌 裂解。
溶菌性生长(lysogenic pathway):整合到 宿主菌DNA分子中,随宿主菌DNA复制并转到 子代细菌中。
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2λ噬菌体结构
野生型的λ噬菌体基因组庞大而复杂,有约48.5kb,约占基因组总长 度30%的中间部分的基因对噬菌体生长是非必需的,可以直接插入外源 基因或切除该区域而由外源基因代替而不影响噬菌体的生存。
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二、质粒载体
1 概念
Plasmid : 细 菌 染 色 体 外小型双链环状DNA,对 细菌的某些代谢活动和抗 药性的表型具有一定的作 用。
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2 严紧型质粒与松驰型质粒的区别
严紧型质粒
松驰型质粒
质粒复制所需的酶
DNA聚合酶 Ⅲ
每个细胞中所含的质 粒数
1~5个
DNA聚合酶Ⅰ 10~200个以上
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